Este protocolo descreve imagens in vivo estabilizadas e repetitivas do pâncreas com uma nova janela de imagem intravital pancreática. A principal vantagem desta técnica é que é possível realizar imagens tridimensionais imóveis com resolução até o nível celular ao longo de três semanas no pâncreas de um rato vivo. Comece preparando a plataforma cirúrgica e desinfetando as superfícies com 70% de etanol.
Após a anestesia, use uma sonda retal com uma almofada de aquecimento controlada por homeotermica para monitorar a temperatura corporal. Remova o cabelo do flanco esquerdo do mouse e aplique álcool e iodo alternativamente, girando do local da incisão para a superfície externa, nunca mais voltando ao local da incisão e terminando com iodo. Em seguida, faça uma incisão de 1,5 centímetros no flanco esquerdo do rato, dissecando a pele e o músculo.
Use uma sutura 4-0 preta ou nylon para realizar uma sutura de corda de bolsa na margem de incisão. Puxe o baço cuidadosamente com fórceps do anel e identifique o pâncreas. Colocando a janela no flanco do mouse, passe o baço e o pâncreas pelo espaço aberto da janela.
Em seguida, coloque suavemente o pâncreas na placa da janela de imagem enquanto coloca o baço no espaço aberto da janela. Injete panc-1 nuclite vermelho diretamente no pâncreas. Use uma agulha de cateter de calibre 31 para aplicar gotas de cola cianoacrilato n-Butyl à margem da janela de imagem, garantindo a aplicação de uma quantidade mínima de cola.
Aplique suavemente um vidro redondo de cobertura de 12 milímetros à margem da janela de imagem. Em seguida, segure o laço de sutura para caber no sulco lateral da janela e amarrá-lo três vezes. Finalmente, para evitar a interrupção desses pontos apertados quando os ratos estiverem acordados, corte o local máximo proximal da gravata.
Comece ligando o microscópio intravital, incluindo a potência do laser. Para inserir um cateter vascular, aplique pressão no lado proximal da cauda com o índice e o terceiro dedo. Se necessário, aqueça a cauda com uma lâmpada.
Desinfete a veia traseira com um spray de 70% de etanol, em seguida, insira um cateter de calibre 30 na veia traseira lateral e visualize a regurgitação de sangue no tubo PE-10. Aplique fita de seda no cateter para estabilizá-la. Injete fitc dextran e dextran TMR, ou outras sondas fluorescentes conforme apropriado, de acordo com a combinação de sondas fluorescentes.
Insira uma sonda retal para controlar automaticamente a temperatura corporal com um sistema de almofada de aquecimento homeotémico. Em seguida, insira a janela de imagem pancreática preparada durante a configuração da microscopia intravital no suporte da janela. Transfira o mouse da plataforma cirúrgica para o estágio de imagem.
Para realizar imagens intravitais, comece com a imagem do pâncreas em uma baixa ampliação, como quatro vezes, para escanear toda a visão do pâncreas na janela de imagem pancreática. Uma vez determinada a região de interesse, mude para uma lente objetiva de ampliação mais alta, como 20 vezes ou 40 vezes, para realizar imagens de nível celular com resolução lateral e axial aproximadamente 0,5 micrômetros e 3 micrômetros, respectivamente. Execute imagens de pilha Z ou time-lapse para observar a estrutura 3D ou dinâmicas de nível celular, como migração celular.
A microscopia intravital combinada com a janela de imagem intravital pancreática fornece estabilidade tecidual de longo prazo que permite a aquisição de imagens de alta resolução para rastrear ilhotas individuais por até três semanas. A janela implantada em um mouse C57 preto 6 N com anticorpo anti-CD31 injetado por via intravenosa, conjugado com um fluoróforo Alexa 647, facilitou imagens de ampla área e imagens 3D ampliadas do pâncreas. As células acinar foram identificadas nas imagens médias do tecido pancreático na vasculatura adjacente, visualizadas com autofluorescência e anticorpo anti-CD31, respectivamente.
Usando o método de imagem de mosaico, que combina uma visão de campo largo com imagens de alta resolução, aproximadamente 40 a 50 ilhotas com a vasculatura adjacente foram visualizadas em um mouse MIP-GFP. Um estudo anterior mostrou que as ilhotas podem ser rastreadas por até três semanas usando este método de imagem estável. Para visualizar as células cancerígenas, as células vermelhas nuclites PANC-1 foram implantadas diretamente no pâncreas do rato durante a cirurgia e os vasos próximos foram manchados com anti-CD31 conjugado com Alexa 647.
Usando este protocolo, foram geradas imagens de campo amplo do câncer de pâncreas. Isso ajudou a delinear a margem do tumor, bem como alcançar imagens 3D de alta resolução no nível de célula única. O passo mais crítico neste método é a implantação hábil da janela de imagem pancreática no mouse.
Usando outras combinações das células fluorescentes do rato, e sondas de anticorpos, a interação dinâmica de células próximas com ilhotas ou células de cancelamento poderia ser identificada. Este método pode ser amplamente aplicado por aqueles que exploram a mudança da ilhota em várias condições fisiopatológicas e microambientais do câncer de pâncreas in situ.
