このプロトコルは、新しい膵臓のインビタルイメージングウィンドウを用いた膵臓の細胞レベルの安定化および反復的な細胞レベルを記述する。この技術の主な利点は、生きたマウスの膵臓で3週間にわたって細胞レベルまでの解像度で動かない3次元イメージングを行うことが可能である。手術プラットフォームを準備し、70%エタノールで表面を消毒することから始めます。
麻酔後、体温をモニタリングするために、ホーム熱制御加熱パッド付き直腸プローブを使用します。マウスの左脇腹から毛髪を取り除き、アルコールとヨウ素を代わりに塗布し、切開部位から外表面に回転し、切開部位に戻ることはなく、ヨウ素で終わる。その後、マウスの左脇腹に1.5センチメートルの切開を行い、皮膚と筋肉を解剖する。
黒またはナイロンの4-0縫合糸を使用して、切開マージンで財布ひも縫合を行います。リング鉗子で慎重に脾臓を引っ張り、膵臓を識別します。マウスの脇腹に窓を置き、窓の空きスペースを通して脾臓と膵臓を渡します。
次に、窓の空きスペースに脾臓を置きながら、画像窓のプレートに膵臓をそっと置きます。膵臓に直接PANC-1ナクリテレッドを注入します。31ゲージのカテーテル針を使用して、n-ブチルシアノアクリル酸接着剤の滴をイメージングウィンドウのマージンに塗布し、最小限の接着剤を塗布します。
12ミリメートルの丸いカバーガラスを撮像窓の余白にそっと塗布します。次に、縫合ループを保持して窓の側面溝に収まり、3回結びます。最後に、マウスが起きているときにこれらのタイトなステッチの中断を防ぐために、ネクタイの最大近位部位を切断する。
レーザーパワーを含む生体内顕微鏡のスイッチをオンにすることで開始します。血管カテーテルを挿入するには、人差し指と第3指で尾部の近位側に圧力をかける。必要に応じて、ランプで尾を加熱します。
70%エタノールスプレーで尾静脈を消毒し、30ゲージのカテーテルを側面尾静脈に挿入し、PE-10チューブ内の血液の逆流を可視化します。カテーテルに絹テープを貼って安定させる。蛍光プローブの組み合わせに従って、FITCデキストランおよびTMRデキストラン、または他の蛍光プローブを適宜噴射します。
直腸プローブを挿入して、家庭温熱パッドシステムで体温を自動的に制御します。次に、インビタル顕微鏡のセットアップ時に準備した膵臓イメージングウィンドウを窓ホルダーに挿入します。手術用プラットフォームからイメージング段階にマウスを移します。
生体内イメージングを行うために、膵臓の画像化を4回などの低倍率でイメージングし、膵臓イメージングウィンドウ内の膵臓の全景をスキャンする。対象領域が決定されたら、20倍または40倍のような高倍率対比レンズに切り替え、それぞれ約0.5マイクロメートルおよび3マイクロメートルの横方向および軸解像度で細胞レベルのイメージングを行います。Zスタックまたはタイムラプスイメージングを行い、細胞移動などの3D構造または細胞レベルのダイナミクスを観察します。
膵臓内イメージングウィンドウと組み合わせた生体内顕微鏡検査は、高解像イメージングの取得を可能にする長期組織安定性を提供し、個々の膵島を最大3週間追跡します。C57黒6Nマウスに静脈内注射抗CD31抗体を埋め込んだ窓は、Alexa 647フルオロフォアと共役し、広域イメージングを促進し、膵臓の3Dイメージングを拡大した。Acinar細胞は、隣接する血管系における膵臓組織の平均画像で同定され、それぞれ自己蛍光および抗CD31抗体を用いて可視化された。
広視野と高解像度の画像を組み合わせたモザイクイメージング法を用いて、隣接する脈管構造を有する約40~50個の小島をMIP-GFPマウスで可視化した。以前の研究では、この安定したイメージング法を使用して、小島を最大3週間追跡できることが示されました。がん細胞を可視化するために、PANC-1ヌクリテライト赤細胞を手術中にマウス膵臓に直接移植し、近くの血管をAlexa 647と共役した抗CD31で染色した。
このプロトコルを用いて、膵臓癌の広視野画像が生成された。これは、腫瘍のマージンを引き出すだけでなく、単一の細胞レベルで高解像度の3D画像を達成するのに役立ちました。この方法で最も重要なステップは、マウスの膵臓画像化窓の巧みな移植です。
蛍光マウス細胞と抗体プローブの他の組み合わせを用いて、近くの細胞と小島またはキャンセル細胞の動的相互作用を同定することができた。この方法は膵臓癌の様々な病態や微小環境における膵島の変化をその場で探求する者によって広く応用できる。
