Uno de los principales desafíos en la ingeniería de un tejido cardíaco humano incluye su vascularización. Nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo in vitro del corazón humano mediante el co-cultivo de células encontradas in vivo. Estos incluyen miocitos cardíacos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales cardíacas.
En conjunto, estas células permiten la recapitulación del microambiente cardíaco humano, incluyendo sus componentes moleculares, celulares y celulares adicionales. Los usamos en nuestro laboratorio para probar diferentes fármacos en busca de ensayos de toxicidad de fármacos. Estos incluyen doxorubicina, un conocido fármaco cardiotóxico que afecta a los corazones humanos incluso años después de su tratamiento.
Cultivamos fibroblastos cardíacos, células endoteliales y miocitos por separado antes de formar esferoides. Con el fin de crecer cardiomiocitos, recogemos el vial de menos 80 grados y lo calentamos a 37 grados durante cuatro minutos en un baño de agua. Luego rociamos el vial de crio con 70% de etanol y lo trasladamos a un gabinete de biosemaseidad.
Recogemos suavemente la suspensión celular y la transferimos a un tubo Falcon de 15 mililitros. Recogemos un mililitro de medio de chapado precing, enjuagamos el vial de crio una vez y luego lo añadimos al tubo Falcon de 50 mililitros, una gota a la vez cada cuatro segundos. Mientras añade el medio de chapado, agite suavemente el tubo Falcon.
Con una pipeta de celda, recoja siete mililitros de medio de chapado y agréguelo suavemente al tubo Falcon de 15 mililitros. Una vez añadido el volumen final del medio de chapado al tubo Falcon, transfiera la suspensión celular a los matraces de tejido codificado con fibronectina. Finalmente, mueva las células a una incubadora.
Después de dos días, recogemos los matraces de tejido de la incubadora y comprobamos la confluencia celular bajo el microscopio. En este punto, movemos el matraz a un armario de biosemase y retiramos el medio de chapado. Enjuagamos suavemente las células con el mismo medio de chapado del matraz tisular cuatro o cinco veces.
Lo reemplazamos por un nuevo medio de mantenimiento y los trasladamos a una incubadora durante uno o dos días adicionales. El día que creamos colgantes de cultivos, recogemos los tres tipos de células de la incubadora. Nos astillamos en las células quitando los medios.
Los enjuagamos con tres mililitros de PBS. Y finalmente añadimos los chips a las celdas. Los frascos se trasladan a una incubadora y se incuban durante un máximo de cinco minutos.
Con el fin de generar esferoides cardíacos, co-cultivamos 20.000 células por gota colgante. Estos incluyen 10.000 cardiomiocitos, mil fibroblastos cardíacos y 5.000 células interiores cardíacas. Estos son co-cultivados en gota colgante 384 placas de pozo.
Están chapados usando nuestro sistema de manipulación de líquidos. También añadimos PBS en las paredes laterales de las placas colgantes para evitar que los cultivos se sequen en la incubadora. Mueva cuidadosamente la placa colgante que contiene las células a la incubadora.
Entre tres y cuatro días, se formará esferoide. Recogemos la placa colgante de la incubadora y comprobamos que los esferoides se están formando dentro de cada pozo. Como se muestra en estas imágenes, tenemos un conjunto de esferoides dentro del centro de cada pozo.
Una vez formados, recogemos esferoides y los incrustamos en geles de colágeno. Una punta de pipeta se corta en el interior para evitar daños en el esferoide. Los esferoides se recogen y se transfieren a un tubo Falcon de 50 mililitros donde se juntan.
Giramos hacia abajo la suspensión del esferoide a 300 G durante cinco minutos para separarlos del medio. Utilizamos placas de 96 pozos de paredes oscuras para imaginar los esferoides, el medio se retira o se reemplaza con un gel de colágeno en un tubo Falcon. El hidróxido de sodio se añade a la suspensión de gel esferoide antes de que estén chapados en la placa de pared oscura.
100 microlitro de suspensión de esferoides se añade en cada pozo y se incuba durante 30 minutos a 37 grados. Los medicamentos, incluyendo doxorubicina y otros agentes, se añaden a la placa esferoides y se incuban durante 24 horas. Al día siguiente, preparamos una solución que contiene calcio AM y e-tidio homodimer, etiquetado vivo bajo las células respectivamente.
Esta solución se prepara en la adición de la moneda de diez centavos a esta placa de filtro. Los esferoides se incuban a 37 grados durante una hora. Utilizamos un lector de placas para medir la fluorescencia del calcio AM y su homodimero de etidium en la placa.
Estas mediciones son utilizadas por nuestro software para realizar un análisis estadístico. Medimos la actividad contráctil de los esferoides tratados con los diferentes fármacos utilizando un sistema óptico iónico. Los esferoides se mueven al escenario entre dos electrodos.
Esto permite controlar y medir la actividad contráctil por potencial de campo. De esta manera, podemos probar diferentes voltajes y rangos de frecuencia para estimular los esferoides. Un esferoide en ese momento se valora y se utiliza para esas mediciones.
Los esferoides que no recibieron doxorubicina podrán construir después de la estimulación eléctrica. Por el contrario, los esferoides tratados con doxorubicina no se contraen. Para visualizar el formulario de red celular endotelial dentro de cada esferoide, los arreglamos con una solución de 4%paraformaldehído durante una hora a temperatura ambiente.
Trasladamos la placa a una coctelera que permite la suave permeación de la solución a través del gel. El PFA se retira y enjuaga tres veces con una solución de PBS que contiene 0,01%óxido de sodio. Trajimos la movilización, por supuesto, añadiendo una solución del 0,02% de Tritón X en PVSA durante 20 minutos a temperatura ambiente.
La solución de bloqueo contiene 3%BSA en PBC, que luego se añade a la placa durante una hora a temperatura ambiente. Una solución que contiene el anticuerpo primario contra el CD 31. Se añade un marcador para el endotelial a la placa que luego se incuba durante la noche a cuatro grados.
Al día siguiente, se elimina la solución de anticuerpos primarios y la placa se enjuaga tres veces con una solución de PBS que contiene 0,01% de óxido de sodio. La solución de anticuerpos secundaria que contiene también la mancha hexagonal se añade a la placa que luego se incuba durante la noche a cuatro grados. Finalmente, se elimina la segunda solución de anticuerpos y la placa se enjuaga tres veces con una solución PBS que contiene 0,01% de óxido de sodio.
Después de permanecer con anticuerpos primarios y secundarios, la placa se puede utilizar con nuestro microscopio confocal. Una red vascular adecuada es fundamental para la supervivencia y la función de las células cardíacas. Los esferoides cardíacos presentan una red celular endotelial que recapitula mejor la presente en el corazón humano en comparación con los cultivos monocapa de células cardíacas.
Dadas las características únicas, los esferoides cardíacos representan herramientas avanzadas para pruebas in vitro para la investigación cardiovascular.
