Las células T Gamma-Delta tienen una poderosa actividad citotóxica contra muchos tipos de cáncer, incluida la leucemia mieloide aguda. Sin embargo, las células T Gamma-Delta circulantes en una sangre son relativamente raras, particularmente en pacientes con neoplasias malignas. La infusión de células T Gamma-Delta expandidas X-vivo derivadas de donantes, son prometedoras para reducir la recurrencia de la leucemia y mejorar la supervivencia de los pacientes con leucemia mieloide aguda.
El método propuesto logra una expansión de células T Gamma-Delta superior a 200.000 veces, alcanzando dosis terapéuticamente relevantes de un producto de células T Gamma-Delta altamente puro, en tres sencillos pasos. Por lo tanto, ligando un IEL a la expansión, el agotamiento de las células T alfa beta por clasificación magnética y la expansión secundaria de recompensa con AAPCs. El método propuesto amplía la utilidad de las células T Gamma-Delta para enfermedades como el cáncer y las enfermedades autoinmunes al crear rápidamente una gran cantidad de células que se pueden usar en el estante.
Este proceso podría adaptarse para expandir las células Gamma-Delta utilizando diferentes métodos de enriquecimiento y agregando manipulaciones adicionales como la transducción. La demostración del procedimiento se realizará en Los Ángeles, un tecnólogo de terapia celular, tres de mi laboratorio. Comience por la elutriación de la muestra del producto de efervescencia, en el dispositivo de centrifugación de contraflujo, utilizando un medio primario de solución salina equilibrada de Hanks, con albúmina sérica humana al 1% y el medio secundario de solución salina o DPBS.
Con la velocidad de centrifugación de elutriación a 900 veces G, recolecte fracciones basadas en el caudal y el tiempo. Recoger las muestras de la fracción dos para realizar las pruebas de esterilidad, recuento celular y fenotipado celular por citometría de flujo. A partir de la fracción dos, expanda una fracción de linfocitos puros de células en cultivo a 10 veces 10 hasta la sexta célula por centímetro cuadrado, con cinco micromoles por litro de ácido zoledrónico y 300 unidades por mililitro de interleucina-2 en un biorreactor de sistema cerrado de un litro.
Incubar el sistema durante siete días a 37 grados centígrados, con un 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, recolecte las células del matraz biorreactor de sistema cerrado de un litro. Para hacerlo, suelde estérilmente un paquete de transferencia de un litro a la línea roja del biorreactor y use la bomba farmacéutica adecuada para transferir las células al paquete de transferencia.
Tome las muestras para la prueba de esterilidad media gastada, recuento de células y fenotipado celular por citometría de flujo. De la muestra restante, vuelva a suspender las células cinco veces 10 a las octavas células por mililitro, en tampón PBS-EDTA que contiene 0.5% HSA y receptor de células T biotiniladas, anticuerpo específico alfa beta. E incubar las células a dos a ocho grados centígrados con temblores.
Después de 15 minutos, lave las células con 600 mililitros de tampón PBS-EDTA que contenga 0.5 HSA y centrífuga a 200 a 500 veces G durante 15 minutos, a dos a ocho grados Celsius, para eliminar el anticuerpo no unido. Luego, vuelva a suspender las células aproximadamente cinco veces 10 a las octavas células por mililitro, en tampón PBS-EDTA que contiene 0.5% HSA y 7.5 mililitros por vial de microperlas específicas anti-biotina. Como se describió anteriormente, incube las células con agitación, antes de centrifugar la suspensión celular para eliminar las microperlas no unidas.
Vuelva a suspender seis veces 10 a la séptima celda por mililitro en tampón PBS-EDTA con 0.5% HSA. Recógelos en una bolsa de transferencia. Pincharlo cuando el instrumento se lo indique.
A continuación, instale un conjunto de tubos en el dispositivo de separación de células magnéticas de grado clínico. Coloque los paquetes con el búfer PBS-EDTA y el paquete de transferencia con el producto de la celda en el instrumento. Para el agotamiento de las células T alfa beta etiquetadas, seleccione el protocolo de agotamiento 1.2 en el software.
Luego, centrifugue el producto celular para recolectar la fracción objetivo enriquecida con células T Gamma-Delta. Vuelva a suspender las células recolectadas en el medio, complementado con 10% de suero AB humano. Realizar un recuento celular de viabilidad y citometría de flujo fenotipando post agotamiento.
Llevar las células a una concentración final de aproximadamente una vez 10 a la sexta célula por mililitro. Irradiar cinco veces 10 a la séptima célula presentadora de antígenos artificiales o AAPCs por matraz, a 100 grises en el instrumento generador de rayos X. Preparar un cocultivo, colocando los AAPCs irradiados y las células T Gamma-Delta en la proporción de 10 es a uno, en matraces biorreactores de sistema cerrado de un litro.
Con un litro de medio de cultivo, complementado con suero AB humano al 10%, sembra hasta 10 matraces. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 10 días, con un cribado de los niveles de glucosa y lactato cada tres o cuatro días utilizando tiras, glucosa y un medidor de lactato. Si el nivel de glucosa desciende a 215 miligramos por decilitro, reduzca el volumen en el matraz a 200 mililitros.
Mezcle las células en los 200 mililitros restantes de medios y retire una muestra de 0,5 mililitros para el recuento celular y la medición de la viabilidad mediante tinción de naranja acridina o yoduro de propidio. Si el recuento de células es igual o superior a 10 al noveno, divida el contenido de un matraz en dos y llene cada matraz hasta un litro con medio AIM-V, complementado con suero AB humano al 10%. Si el recuento de células es inferior a 10 a la novena, alimente las células con un litro fresco de medio de cultivo, complementado con suero AB humano al 10%, y devuelva los matraces a la incubadora.
Al final de 10 días en cocultivo, cosecha los matraces del biorreactor uno a la vez y tira de todas las células en un paquete de transferencia del tamaño adecuado. Después de extraer las muestras de control de calidad, centrifugue las células a 200 a 500 veces G durante 15 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Lave las células en una solución de solución cristaloide equilibrada, suplementada con 0,5% HSA a 200 a 500 veces G durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Vuelva a suspenderlos en un volumen objetivo de 100 a 300 mililitros de solución cristaloide equilibrada con 0,5% de HSA. Las celdas se separaron de la fracción de centrifugación posterior al contraflujo. Dos produjeron una población de linfocitos puros, con una excelente viabilidad promedio del 95,80%La expansión específica de las células T Gamma-Delta, con ácido zoledrónico dependió del porcentaje inicial de células asesinas naturales presentes en la fracción de linfocitos después de la elutriación.
El enriquecimiento de la sustancia farmacológica de células T Gamma-Delta, con agotamiento del receptor de células T alfa beta fue consistente. El producto farmacéutico de células T Gamma-Delta fabricado a partir de tres donantes sanos, cumplió con el criterio de liberación de menos del 1% de células T receptores de células T alfa beta positivas, con un promedio de 0,11% de células B CD20 positivas y 0,00% de células T receptores de células T alfa beta positivas. El porcentaje promedio de células asesinas naturales en el producto final fue de alrededor del 17,06%, que cumplieron con el criterio de liberación de menos del 35%La tinción de la superficie celular y el análisis citométrico de flujo, se utilizaron para caracterizar la identidad, la pureza y las impurezas del proceso de la sustancia farmacéutica y el producto farmacéutico.
La segunda reexpansión lograda a partir del cocultivo de la sustancia farmacológica de células T AAPC y Gamma-Delta, generó un producto farmacéutico de células T Gamma-Delta que cumplió con todos los criterios de liberación. Los pathons que enriquecen la población de células T afectan la expansión y las características del producto. Se requiere suficiente consideración e investigación de los métodos de enriquecimiento, antes de iniciar su proceso de enriquecimiento.
