Las lesiones de globo abierto pueden conducir a la pérdida permanente de la visión si no se tratan. Este modelo de cultivo de órganos del segmento anterior permite la evaluación de estas lesiones dentro de la necesidad de pruebas en animales. Este protocolo permite el seguimiento de lesiones de globo abierto, y terapéutico, para estabilizar la lesión durante tres o más días con una plataforma de cultivo de órganos.
Demostrando el procedimiento estará Trent Pearson, un técnico de investigación del laboratorio Dr.Boice. Para comenzar, coloque la cortina quirúrgica y los instrumentos necesarios para la disección gruesa. Configure el gabinete de bioseguridad para visualizar los ojos en el microscopio de disección.
Configure el gabinete de bioseguridad para el montaje del plato. Configure el espacio de trabajo de inducción de lesiones de globo abierto dentro del gabinete de bioseguridad. Coloque el vicio de seguimiento cruzado en el gato de laboratorio, frente a la plataforma de punción.
Después de extraer los tejidos orbitarios adicionales y lavar los ojos con pbs antimicótico antibiótico, para hemisectar el ojo, coloque el ojo sobre la gasa antimicótica antimicótica PBS empapada. Use una hoja de afeitar estéril o un bisturí para crear una incisión cerca del ecuador del ojo. Luego hemisecte el ojo usando tijeras quirúrgicas curvas para aislar el ojo anterior.
Use micro tijeras como pala para extraer el humor vítreo del segmento anterior y retire la lente del segmento anterior con micro tijeras. Corta gradualmente el iris a la raíz del iris radialmente hasta que la malla trabecular sea visible. Extienda el corte 360 grados alrededor del iris, para exponer toda la región de malla trabecular y limpie cualquier iris residual restante que cubra la malla trabecular si es necesario.
Recorte los restos del cuerpo ciliar posteriores a la región de malla trabecular dejando solo una banda delgada de un milímetro del tejido. Después de colocar el segmento anterior en la placa de Petri. Humedezca un hisopo de algodón en el medio y aplique suavemente en el centro de la córnea para eliminar cualquier pigmento.
Sostenga los ojos con las pórceps y elimine el pigmento adicional alrededor de la esclerótica limpiándolo. Coloque el segmento anterior invertido sobre la región elevada del plato inferior, asegurándose de que la córnea permanezca en el centro de la región elevada. Coloque el anillo de sujeción en la parte superior del segmento anterior recién colocado y apriete suavemente los tornillos con la tecla L.
Conecte ambos conectores fluídicos con oídas a puertos roscados en la parte inferior del plato. Al primer conector fluídico conecte 18 bujes de aguja doblada de calibre 90 grados, una longitud de tubo, un cubo de aguja de calibre 18, un filtro de jeringa de nylon, una válvula de tres vías y una jeringa de 20 milímetros llena de medios. Al segundo conector fluídico conecte 18 bujes de aguja doblados de calibre 90 grados, una longitud de tubo, un cubo de aguja de calibre 18, una válvula de tres vías como se demostró para el primer conector de fluido y luego conecte la porción del barril de una jeringa estéril de 10 mililitros, que actuará como un depósito para atrapar el líquido y las burbujas.
Manteniendo las válvulas de tres vías abiertas adecuadamente a las jeringas, empuje suavemente el medio a través del sistema, utilizando el primer puerto de conector de fluidos. Para inflar el segmento anterior, llene el tubo con medios y, finalmente, llene el depósito. Retire las burbujas empujando suavemente los medios dentro del plato e invierta el plato para empujar las burbujas.
Coloque el plato de cultivo de órganos del segmento anterior en la incubadora de cultivo celular. Dirija las líneas de tubería a través de la parte inferior de la puerta de la incubadora para evitar interferencias con la apertura y el cierre de la puerta. Coloque las líneas de tubería con el depósito en el instrumento del transductor de presión.
Conecte la válvula lateral de tres vías al transductor de presión configurado mientras PBS fluye a través de la línea para evitar que las burbujas de aire entren en las líneas de tubería. Dentro del gabinete de bioseguridad preparado para la inducción de lesiones abiertas, ajuste el regulador de presión en la plataforma de punción a una fuerza de 50 libras por pulgada cuadrada para generar una fuerza de punción adecuada en los objetos de hasta 4.5 milímetros de diámetro. Coloque el vicio de seguimiento cruzado en el conector de laboratorio frente a la plataforma de punción.
Extienda el brazo del pistón a su distancia máxima y coloque el ápice corneal dentro de la región de un milímetro del objeto punzante, retraiga el brazo del pistón y acerque el segmento anterior un centímetro más al objeto punzante. Para encender el dispositivo de punción, encienda el dispositivo y abra la válvula solenoide con el segundo interruptor del dispositivo. Para retraer el dispositivo del ojo, presione el segundo interruptor, verifique la inducción adecuada de la lesión mediante la inspección visual y la fuga de medios del sitio de la lesión.
Después de la cirugía, la integridad del epitelio corneal se evaluó mediante imágenes mediante tomografía de coherencia óptica. El tejido del segmento anterior lesionado fue fotografiado inmediatamente después de la lesión y 72 horas después de la lesión. Los ojos controlados no muestran una interrupción notable en la córnea, mientras que las lesiones claras se localizaron a través de la córnea después de la lesión.
A partir de la proyección de intensidad máxima de arriba hacia abajo, fue evidente que las lesiones eran irregulares en forma y tamaño, pero el tamaño de la lesión disminuyó durante 72 horas. Se observó presión interocular durante los primeros tres días antes de la cirugía para determinar la estabilidad de la presión en el rango aceptable. En los resultados representativos, tres de cada cinco ojos se encuentran dentro del rango de presión interocular aceptable.
La presión interocular cambia debido a la lesión del globo abierto y la intervención terapéutica. Después de la inducción de la lesión de globo abierto, la presión disminuyó significativamente y se mantuvo baja hasta que se completó el experimento. El tratamiento de los tejidos lesionados con adhesivo dermabond resultó en un aumento de la presión interocular en comparación con el tejido no tratado, lo que indica que este método se puede utilizar para medir la eficacia de la terapéutica para restaurar la presión intraocular.
La configuración inicial del segmento en el cultivo de órganos es fundamental para la estabilidad a largo plazo del tejido. Apretar demasiado el anillo puede causar estrés en el tejido y reducir el cumplimiento.
