Травмы открытого земного шара могут привести к постоянной потере зрения, если их не лечить. Эта модель культуры органов переднего сегмента позволяет оценить эти травмы в рамках необходимости тестирования на животных. Этот протокол позволяет отслеживать травмы открытого земного шара и терапевтические средства для стабилизации травмы в течение трех или более дней с помощью платформы для культуры органов.
Продемонстрировать процедуру будет Трент Пирсон, техник-исследователь из лаборатории Доктора Бойса. Для начала положите хирургическую драпировку и инструменты, необходимые для грубого рассечения. Настройте шкаф биобезопасности для визуализации глаз на рассекаемом микроскопе.
Настройте шкаф биобезопасности для сборки блюд. Установите рабочее пространство для индукции травм с открытым глобусом внутри шкафа биобезопасности. Расположите поперечный след на лабораторном домкрате, перед проколотой платформой.
После удаления лишних орбитальных тканей и промывания глаз антибиотиком антимикотическим PBS, для гемисектирования глаза поместите глаз на антибиотик антимикотической PBS, пропитанной марлей. Используйте стерильный бритвенный клинок или скальпель, чтобы создать разрез вблизи экватора глаза. Затем гемисект глаз с помощью изогнутых хирургических ножниц, чтобы изолировать передний глаз.
Используйте микроножницы в качестве лопаты, чтобы зачерпнуть стекловидное тело из переднего сегмента и удалить хрусталик из переднего сегмента с помощью микроножниц. Постепенно срежьте радужную оболочку до корня радужки радиально, пока не будет видна трабекулярная сетка. Вытяните разрез на 360 градусов вокруг радужной оболочки, чтобы обнажить всю область трабекулярной сетки и при необходимости очистить оставшуюся остаточную радужную оболочку, покрывающую трабекулярную сетку.
Обрежьте остатки цилиарного тела с задней части трабекулярной сетки, оставив только один миллиметр тонкой полосы ткани. После помещения переднего сегмента в чашку Петри. Смочите ватный тампон в среде и аккуратно нанесите на центр роговицы, чтобы удалить пигмент.
Удерживайте глаза щипцами и удалите лишний пигмент вокруг склеры, вытирая. Поместите перевернутый передний сегмент над приподнятой областью нижней чашки, следя за тем, чтобы роговица оставалась в центре возвышенной области. Поместите зажимное кольцо поверх вновь размещенного переднего сегмента и аккуратно затяните винты клавишей L.
Прикрепите оба жидкостных разъема с уплотнительными кольцами к резьбовым портам на дне тарелки. К первому жидкостному разъему прикрепите 18 калибр 90 градусов изогнутую игольчатую ступицу, длину трубки, игольчатую ступицу 18 калибра, фильтр нейлонового шприца, трехсторонний клапан и 20-миллиметровый шприц, заполненный средой. Ко второму жидкостному разъему прикрепите 18 калибр 90 градусов изогнутую игольчатую ступицу, длину трубки, игольчатую ступицу 18 калибра, трехсторонний клапан, как показано для первого соединителя жидкости, а затем прикрепите бочкообразную часть стерильного 10-миллилилитрового шприца, который будет действовать как резервуар для улавливания жидкости и пузырьков.
Держа трехходовые клапаны соответствующим образом открытыми для шприцев, осторожно проталкивайте жим через систему, используя первый разъем для жидкости. Чтобы надуть передний сегмент, заполните трубку средой и в конечном итоге заполните резервуар. Удалите пузырьки, осторожно вдавливая носитель в блюдо, и переверните блюдо, чтобы вытолкнуть пузырьки.
Поместите чашку для культуры переднего сегмента органа в инкубатор клеточной культуры. Направляйте линии трубки через нижнюю часть дверцы инкубатора, чтобы предотвратить вмешательство в открытие и закрытие двери. Расположите линии НКТ с резервуаром на приборе преобразователя давления.
Подключите боковой трехсторонний клапан к датчику давления, установленному во время протекания PBS через линию, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в трубные линии. Внутри подготовленного шкафа биобезопасности для открытой травмы индукции установлен регулятор давления на проколотой платформе до 50 фунтов силы на квадратный дюйм для создания адекватной силы прокола на объектах диаметром до 4,5 миллиметров. Расположите поперечный след на лабораторном домкрате перед проколотой платформой.
Вытяните кронштейн поршня на максимальное расстояние и расположите вершину роговицы в пределах одного миллиметра от прокалывного объекта, втяните поршневой рычаг и поднесите передний сегмент на один сантиметр ближе к прокалываемого объекта. Чтобы выстрелить проколом, включите устройство и откройте электромагнитный клапан вторым переключателем на устройстве. Чтобы оттянуть устройство от глаза, нажмите второй переключатель, проверьте правильность индукции травмы путем визуального осмотра и утечки среды из места травмы.
После операции целостность эпителия роговицы оценивалась с помощью визуализации с использованием оптической когерентной томографии. Поврежденная ткань переднего сегмента была сфотобирована сразу после травмы и через 72 часа после травмы. Контролируемые глаза не показывают заметных нарушений в роговице, в то время как явные травмы были расположены через роговицу после травмы.
Из нисходящего прогноза максимальной интенсивности было очевидно, что травмы были неправильными по форме и размеру, но размер травмы был уменьшен в течение 72 часов. Межглазное давление наблюдалось в течение первых трех дней перед операцией для определения стабильности давления в допустимом диапазоне. В репрезентативных результатах три из пяти глаз попадают в допустимый диапазон межглазного давления.
Межглазное давление изменяется из-за травмы открытого земного шара и терапевтического вмешательства. После индукции повреждения открытого земного шара давление значительно снизилось и оставалось низким до завершения эксперимента. Лечение поврежденных тканей клеем дермабольда приводило к повышению межглазного давления по сравнению с необработанными тканями, что указывает на то, что этот метод может быть использован для измерения эффективности терапевтических средств для восстановления внутриглазного давления.
Первоначальная настройка сегмента в культуре органов имеет решающее значение для долгосрочной стабильности ткани. Чрезмерное затягивание кольца может вызвать нагрузку на ткани и уменьшить комплаенс.
