Le lesioni del globo aperto possono portare alla perdita permanente della vista se non trattate. Questo modello di coltura d'organo del segmento anteriore consente di valutare queste lesioni all'interno della necessità di test sugli animali. Questo protocollo consente di tracciare le lesioni open globe e le terapie per stabilizzare la lesione per tre o più giorni con una piattaforma di coltura di organi.
A dimostrare la procedura sarà Trent Pearson, un tecnico di ricerca del laboratorio Dr.Boice. Per iniziare, posare il drappo chirurgico e gli strumenti necessari per la dissezione grossolana. Impostare l'armadio di sicurezza bio per visualizzare gli occhi sul microscopio di dissezione.
Impostare l'armadio di sicurezza bio per l'assemblaggio del piatto. Imposta l'area di lavoro a induzione per lesioni a globo aperto all'interno dell'armadio di sicurezza bio. Posiziona la morsa di tracciamento incrociato sul jack da laboratorio, di fronte alla piattaforma di foratura.
Dopo aver rimosso i tessuti orbitali extra e lavato gli occhi con PBS antimicotico antibiotico, per emisect l'occhio posizionare l'occhio sulla garza antibiotica antimicotica PBS imbevuta. Usa una lama di rasoio sterile o un bisturi per creare un'incisione vicino all'equatore dell'occhio. Quindi emisezionare l'occhio usando forbici chirurgiche curve per isolare l'occhio anteriore.
Usa le micro forbici come una pala per raccogliere l'umore vitreo dal segmento anteriore e rimuovere la lente dal segmento anteriore con micro forbici. Tagliare gradualmente l'iride alla radice dell'iride radialmente fino a quando la rete trabecolare è visibile. Estendere il taglio a 360 gradi attorno all'iride, per esporre l'intera regione di rete trabecolare e pulire l'iride residua rimanente che copre la rete trabecolare, se necessario.
Tagliare i resti del corpo ciliare posteriormente alla regione trabecolare della rete lasciando solo una banda sottile di un millimetro del tessuto. Dopo aver posizionato il segmento anteriore nella capsula di Petri. Bagnare un batuffolo di cotone nel mezzo e tamponare delicatamente al centro della cornea per rimuovere qualsiasi pigmento.
Tenere gli occhi con una pinpetta e rimuovere il pigmento extra intorno alla sclera pulendo. Posizionare il segmento anteriore invertito sopra la regione elevata del piatto inferiore, assicurandosi che la cornea rimanga al centro della regione elevata. Posizionare l'anello di serraggio sopra il segmento anteriore appena posizionato e stringere delicatamente le viti con la chiave L.
Collegare entrambi i connettori fluidici con O-ring alle porte filettate sul fondo della parabola. Al primo connettore fluidico collegare mozzo dell'ago piegato a 90 gradi da 18 calibri, una lunghezza di tubo, un mozzo ad ago calibro 18, un filtro a siringa di nylon, una valvola a tre vie e una siringa da 20 millimetri riempita con supporti. Al secondo connettore fluidico collegare mozzo dell'ago piegato a 90 gradi calibro 18, una lunghezza di tubo, un mozzo ad ago calibro 18, una valvola a tre vie come dimostrato per il primo connettore del fluido e quindi collegare la porzione della canna di una siringa sterile da 10 millilitri, che fungerà da serbatoio per catturare il liquido e le bolle.
Mantenendo le valvole a tre vie aperte in modo appropriato alle siringhe, spingere delicatamente il fluido attraverso il sistema, utilizzando la prima porta del connettore fluidico. Per gonfiare il segmento anteriore, riempire il tubo con i mezzi e infine riempire il serbatoio. Rimuovere le bolle spingendo delicatamente il supporto nel piatto e invertire il piatto per spingere fuori le bolle.
Posizionare la mopia di coltura dell'organo del segmento anteriore nell'incubatore di colture cellulari. Dirigere le linee del tubo attraverso il fondo della porta dell'incubatore per evitare interferenze con l'apertura e la chiusura della porta. Posizionare le linee di tubazione con il serbatoio sullo strumento del trasduttore di pressione.
Collegare la valvola laterale a tre vie al trasduttore di pressione impostato mentre PBS scorre attraverso la linea per evitare che le bolle d'aria entrino nelle linee del tubo. All'interno dell'armadio di sicurezza bio preparato per l'induzione di lesioni aperte impostare il regolatore di pressione sulla piattaforma di foratura a 50 libbre di forza per pollice quadrato per generare un'adeguata forza di foratura sugli oggetti fino a 4,5 millimetri di diametro. Posiziona la morsa di tracciamento incrociato sul jack da laboratorio di fronte alla piattaforma di foratura.
Estendere il braccio del pistone alla sua distanza massima e posizionare l'apice corneale all'interno della regione di un millimetro dell'oggetto di puntura, ritrarre il braccio del pistone e portare il segmento anteriore un centimetro più vicino all'oggetto di puntura. Per accendere il dispositivo di foratura, accendere il dispositivo e aprire l'elettrovalvola con il secondo interruttore sul dispositivo. Per ritrarre il dispositivo dall'occhio, premere il secondo interruttore, verificare la corretta induzione della lesione mediante ispezione visiva e perdite di supporti dal sito della lesione.
Dopo l'intervento chirurgico, l'integrità dell'epitelio corneale è stata valutata tramite imaging utilizzando la tomografia a coerenza ottica. Il tessuto del segmento anteriore ferito è stato ripreso immediatamente dopo l'infortunio e 72 ore dopo l'infortunio. Gli occhi controllati non mostrano interruzioni evidenti nella cornea mentre lesioni chiare sono state localizzate attraverso la cornea dopo la lesione.
Dalla proiezione di intensità massima top-down, era evidente che le lesioni erano irregolari nella forma e nelle dimensioni, ma la dimensione della lesione è diminuita nell'arco di 72 ore. La pressione interoculare è stata osservata per i primi tre giorni prima dell'intervento chirurgico per determinare la stabilità della pressione nell'intervallo accettabile. Nei risultati rappresentativi tre occhi su cinque rientrano nell'intervallo di pressione interoculare accettabile.
La pressione interoculare cambia a causa della lesione open globe e dell'intervento terapeutico. Dopo l'induzione della lesione a globo aperto, la pressione è diminuita significativamente ed è rimasta bassa fino al completamento dell'esperimento. Il trattamento dei tessuti danneggiati con adesivo dermabond ha comportato un aumento della pressione interoculare rispetto al tessuto non trattato, il che indica che questo metodo può essere utilizzato per misurare l'efficacia delle terapie per il ripristino della pressione intraoculare.
La configurazione iniziale del segmento nella coltura degli organi è fondamentale per la stabilità a lungo termine del tessuto. Stringere eccessivamente l'anello può causare stress sul tessuto e ridurre la conformità.
