Este protocolo es significativo porque permite la visualización no solo de si una secuencia potenciadora puede impulsar la expresión, sino también dónde puede impulsar la expresión en una parte particular del cuerpo. Es rápido. Las inyecciones tardan menos de 10 minutos en completarse, y si se expresa y dónde se expresa un gen reportero se puede ver a los pocos días de la recolección de la muestra.
Para comenzar la clonación, elija o diseñe una construcción de reportero. La construcción utilizada aquí coloca al candidato potenciador en las tres regiones principales no traducidas de un gen reportero EGFP expresado bajo el control del promotor mínimo hsp68. Para diseñar los cebadores de PCR para amplificar una secuencia de interés y clonar en el vector, agregue el brazo de homología apropiado para la clonación de Gibson al extremo principal de los cinco cebadores.
Usando los cebadores diseñados, realice PCR a partir de una muestra de ADN. Digiera de uno a 10 microgramos de ADN vectorial usando Pac1 y Asc1, dependiendo del número deseado de reacciones de clonación requeridas. Mediante el empleo de electroforesis en gel de 0,7 a 1% durante 30 a 60 minutos a 100 voltios, separe los fragmentos de digestión de restricción.
Extraiga la banda para el vector lineal y purifíquela con un kit de extracción de gel comercial. Una vez que se complete la clonación de Gibson y la transformación de las células, coloque las células en medios selectivos e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Después de verificar la clonación exitosa de la construcción del reportero, inocule cinco mililitros del cultivo iniciador utilizando el stock de glicerol.
Cultive el cultivo durante ocho a 16 horas en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados y 180 rotaciones por minuto. A medida que el caldo se vuelve turbio, diluya el cultivo iniciador 1, 000x en 250 a 300 mililitros de caldo LB selectivo fresco, e incube durante la noche en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados y 180 rotaciones por minuto. Usando un maxi kit comercial de plásmidos, purifica el plásmido.
Para probar la recombinación de los ITR, realice una digestión Xma1. Visualiza las bandas. Asegúrese de que su resumen muestre el número esperado de bandas.
La recombinación dará como resultado menos bandas de las esperadas. Prepare la mezcla recombinante de AAV para la entrega. Si compara los patrones de expresión de múltiples virus reporteros potenciadores, diluya cada virus para equiparar los títulos de virus al virus menos concentrado.
Mezcle el virus reportero potenciador y el virus reportero de control expresado constitutivamente en una proporción de dos a uno o tres a uno. Agregue una pequeña cantidad de tinte verde rápido con una concentración final de 0.06%Rompa la punta de una pipeta de vidrio tirada hecha de un tubo capilar graduado de microlitro perforándola suavemente en una toallita delicada y sin pelusa. Inserte la pipeta en un conjunto de aspirador con un dispositivo de aplicación de presión conectado a una junta de goma para sostener una pipeta microcapilar.
Extraiga un pequeño volumen de alrededor de 0,2 a 0,5 microlitros de aceite mineral en la pipeta aplicando presión negativa a través del aspirador. Mantenga el conjunto del aspirador a un lado y coloque el virus en hielo hasta que esté listo para inyectarse. Después de crioanestesiar a los ratones neonatos, aplique presión negativa con el conjunto del aspirador y extraiga la mezcla de virus en la pipeta de vidrio tirado hasta que el menisco pase la marca de dos microlitros.
Retire el ratón de la cámara fría y colóquelo en la parte superior del banco. Localice los sitios de inyección bilateral a medio camino entre lambda y bregma, así como la sutura sagital y cada ojo. Desinfectarlos con una toallita con alcohol.
Perforar el cráneo de los ratones neonatos con la pipeta de vidrio tirado. A medida que la aguja entra en el cráneo, aplique una presión positiva a través del conjunto del aspirador. Dispensar un microlitro del virus en el ventrículo lateral y retirar la pipeta.
Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica o una cámara de calentamiento para recuperarse. Devuelva al animal a la jaula de la casa una vez despertado. Grabe imágenes de fluorescencia que atraviesan la sección del cerebro utilizando una lente subjetiva de bajo aumento 5x.
Al localizar el sitio de inyección, evalúe el alcance de la transducción del virus, dependiendo de la densidad e intensidad de las células fluorescentes rojas. Compare los animales que fueron transducidos de manera similar. Grabe imágenes fluorescentes con una lente objetivo de mayor aumento de más de 25x.
A continuación, abra el software de análisis y aplique un filtro mediano de tres por tres para reducir el ruido. Haga clic en el menú Proceso, luego haga clic en Ruido y elija la opción Desspeckle. A continuación, para restar la fluorescencia de fondo de las imágenes, comience separando los canales de una imagen multicanal.
Haga clic en el menú Imagen, luego haga clic en Color y seleccione la opción Dividir canales. Con la herramienta de selección de rectángulos o círculos, dibuje una forma pequeña en un área de la imagen sin celdas fluorescentes. Mida la intensidad de píxeles promedio del fondo haciendo clic en Analizar y luego en Medir, y repita para muestrear varias veces.
Promedie el valor gris medio de cinco a ocho áreas de fondo y elimine los valores decimales. Resta los valores de cada píxel de la imagen seleccionando el menú Proceso y, a continuación, haz clic en Matemáticas y restar. A continuación, introduzca el valor de fondo que desea restar y haga clic en Aceptar. Si es necesario, vuelva a combinar los canales en una imagen multicanal seleccionando el menú Imagen, luego haga clic en Color y seleccione Combinar canales.
Para contar el número de células fluorescentes verdes, oculte el canal verde y dibuje una forma alrededor de la región del cerebro que exprese fluorescencia roja utilizando la herramienta de selección de forma libre. Haga clic en la función Medir para medir el área, la densidad integrada y el valor gris medio del canal rojo en la zona seleccionada. Cuente el número de celdas verdes utilizando una herramienta de selección de varios puntos y normalice el número de celdas verdes por la intensidad integrada del canal rojo.
Después de transducir el informe potenciador que el ratón inyectado intracranealmente en P0 con una construcción positiva de AAV mostró expresión de EGFP impulsada por potenciadores en las capas inferiores medias de la corteza 28 días después de la inyección. El ratón inyectado con una construcción de control negativo en P0 no muestra ninguna expresión de EGFP 28 días después de la inyección, lo que demuestra que los elementos potenciadores se encuentran para impulsar la transcripción de EGFP en el cerebro del ratón. Para visualizar el área transducida con éxito y controlar la variabilidad potencial, se examinaron las bibliotecas de reporteros potenciadores entregados por AAV de diferentes títulos.
La biblioteca de títulos altos de potenciadores candidatos impulsa una amplia expresión de EGFP, mientras que la biblioteca de títulos más bajos de potenciadores candidatos impulsa la expresión dispersa de CGFP en el cerebro del ratón P7. Es vital mezclar el reportero potenciador AAV con el control positivo en cada inyección para distinguir entre potenciadores sin actividad y entregas fallidas. Este procedimiento se puede combinar con inmunohistoquímica, ARN FISH o secuenciación de ARN de una sola célula para determinar en qué tipos de células está activo un potenciador.
