El presente protocolo de imágenes SEM proporciona una herramienta para visualizar y cuantificar la formación de volantes de membrana, protuberancias circulares y copas macropinocíticas en la superficie celular in vitro. SEM proporciona imágenes de alta resolución de la superficie celular que se pueden utilizar para visualizar las actividades de la membrana macropinocítica. Esta técnica se puede utilizar para descubrir nuevas vías de señalización que regulan la macropinocitosis e identificar nuevos estimuladores e inhibidores de la micropinocitosis.
Comience colocando resbalones de cubierta de vidrio estéril en los pocillos de una placa de 24 pocillos utilizando pinzas en autoclave. Luego, sembrar 264.7 macrófagos crudos en la cubierta se desliza a una densidad de 10 a las sextas células por mililitro e incubar la placa durante la noche en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, reemplace el medio en cada pozo con 500 microlitros de medios completos frescos, luego trate previamente los macrófagos durante 30 minutos con un control del vehículo como DMSO o un inhibidor de la macropinocitosis como EIPA.
A continuación, para promover el agitamiento de la membrana, trate las células durante 30 minutos con estimuladores de macropinocitosis, como una solución pma de un micromolar o 100 nanogramos por mililitro de factor estimulante de colonias de macrófagos. Para fijar las células para la microscopía electrónica de barrido, aspire los medios de los pozos y lave los resbalones de la cubierta dos veces con PBS helado, luego incube los resbalones de la cubierta en un fijador durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido de una incubación nocturna a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, sin perturbar la monocapa celular, lave suavemente y luego incube los resbalones de la cubierta en 500 microlitros de cacodilato de sodio de 0.1 motores durante 15 minutos.
Después de dos lavados con 500 microlitros de agua destilada, lave los resbalones de la cubierta dos veces en 500 microlitros de una serie de etanol graduado con una incubación de 10 minutos en cada lavado. Para realizar el secado de puntos críticos, coloque los resbalones de la cubierta en un secador de puntos críticos y cúbralos con etanol al 100%. Luego, presione el botón de encendido y abra el tanque de dióxido de carbono.
Presione el botón de enfriamiento durante aproximadamente 30 segundos hasta que la temperatura disminuya a cero grados centígrados. Luego, presione el botón de relleno hasta que aparezca una burbuja en la ventana de la cámara. A continuación, presione el botón de purga hasta que desaparezca el olor a etanol del escape de purga.
Luego, presione el botón de enfriamiento nuevamente hasta que la temperatura disminuya a cero grados centígrados. Vuelva a presionar los botones completos y de purga para apagarlos. Luego, cierre el tanque de dióxido de carbono.
Vuelva a presionar el fondo frío para apagarlo y, a continuación, pulse el botón de calor. Ajuste la temperatura a 42 grados Celsius y la presión a 1, 200 libras por pulgada cuadrada. Una vez que la presión y la temperatura se estabilicen, presione el botón de sangrado para permitir que la presión disminuya lentamente.
Una vez que la presión de la cámara alcance las 150 libras por pulgada cuadrada, presione la parte inferior de la ventilación y espere hasta que la presión disminuya a cero libras por pulgada cuadrada. Apague el secador de puntos críticos y retire los resbalones de la cubierta. A continuación, utilizando grifos adhesivos de carbono, monte los resbalones de la cubierta en los soportes de muestras de aluminio para microscopía electrónica de barrido, luego proceda a pulverizar el recubrimiento con oro o paladio en un recubridor de pulverización.
Encienda el botón de encendido del recubridor de pulverización. Después de que el vacío alcance los 30 miliastores, enjuague la cámara para eliminar la humedad y el aire apagando el interruptor de gas y girando la válvula de gas fino en sentido contrario a las agujas del reloj. Una vez que el vacío aumente a 200 miliastores, apague el interruptor de gas y espere hasta que el vacío alcance los 30 miliastores.
Luego, enjuague la cámara nuevamente para eliminar la humedad y el aire como se ha demostrado. Después de enjuagar la cámara tres veces, empuje la parte inferior del temporizador y ajuste la perilla de voltaje hasta que el medidor lea 10 miliamperios. Luego, retire los resbalones de la cubierta recubierta de la cámara.
Para visualizar y cuantificar los volantes de membrana, inserte los deslizamientos de la cubierta de la muestra en la cámara de un microscopio electrónico de barrido, cierre la puerta y presione el botón evac. Abra el software de funcionamiento del microscopio y ajuste el voltaje de aceleración a 15 kilovoltios y la distancia de trabajo a 10 milímetros. Pulse el botón Coordenadas y desplácese por el mando hasta que aparezcan las celdas en el centro de la pantalla de observación.
Establezca la ampliación en 3, 500 X e imagine la muestra haciendo clic en el botón Foto. Aquí se muestran imágenes representativas de microscopía electrónica de barrido, que demuestran la formación de volantes de membrana en macrófagos 264.7 crudos después del tratamiento con PMA y factor estimulante de colonias de macrófagos. El pretratamiento de macrófagos con el inhibidor de la macropinocitosis EIPA atenúa la formación de volantes de membrana.
Durante la formación de volantes, la membrana plasmática experimenta distintas etapas morfológicas, incluida una protuberancia de membrana en forma de lámina, un volante de membrana en forma de C y una copa macropinocítica. La formación de volantes de membrana después de los tratamientos con PMA y factor estimulante de colonias de macrófagos se puede cuantificar mediante microscopía electrónica de barrido, mientras que la formación de macropinosomas se puede confirmar mediante técnicas de imagen alternativas, como la microscopía confocal utilizando dextrano rojo de Texas y FM4-64. Las flechas azules indican el erizado de la membrana, mientras que las flechas amarillas y verdes apuntan a los micropinosomas.
Finalmente, la macropinocitosis se puede confirmar y cuantificar a través de la citometría de flujo utilizando un marcador de fase fluida fluorescente como FITC o dextrano rojo de Texas. Además de SEM, también se pueden realizar imágenes de células vivas y análisis de citometría de flujo de internalización de dextrano marcado fluorescentemente para investigar y cuantificar la macropinocitosis.
