Das vorliegende REM-Bildgebungsprotokoll bietet ein Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranrüschenbildung, kreisförmigen Vorsprüngen und makropinozytären Bechern auf der Zelloberfläche in vitro. SEM liefert hochauflösende Bilder der Zelloberfläche, mit denen makropinozytäre Membranaktivitäten sichtbar gemacht werden können. Diese Technik kann verwendet werden, um neue Signalwege zu entdecken, die die Makropinozytose regulieren, und um neue Stimulatoren und Inhibitoren der Mikropinozytose zu identifizieren.
Beginnen Sie damit, sterile Glasabdeckscheine in Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit autoklavierten Pinzetten zu platzieren. Dann säen rohe 264,7 Makrophagen auf die Deckgläser mit einer Dichte von 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter und inkubieren die Platte über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie am folgenden Tag die Medien in jedem Vertiefungsraum durch 500 Mikroliter frisches komplettes Medium und behandeln Sie die Makrophagen dann 30 Minuten lang mit einer Fahrzeugsteuerung wie DMSO oder einem Makropinozytosehemmer wie EIPA.
Als nächstes, um das Membran-Ruffling zu fördern, behandeln Sie die Zellen für 30 Minuten mit Makropinozytose-Stimulatoren, wie einer einmikromolaren PMA-Lösung oder 100 Nanogramm pro Milliliter Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor. Um die Zellen für die Rasterelektronenmikroskopie zu fixieren, saugen Sie die Medien aus den Vertiefungen ab und waschen Sie die Deckblätter zweimal mit eiskaltem PBS, dann inkubieren Sie die Deckscheine in einem Fixiermittel für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius. Am folgenden Tag, ohne die Zell-Monoschicht zu stören, waschen und anschließend die Deckgläser in 500 Mikrolitern 0,1-motorischem Natriumcacodylat für 15 Minuten bebrüten.
Nach zwei Wäschen mit 500 Mikrolitern destilliertem Wasser waschen Sie die Deckblätter zweimal in 500 Mikrolitern einer abgestuften Ethanolserie mit einer 10-minütigen Inkubation in jeder Wäsche. Um eine kritische Punkttrocknung durchzuführen, legen Sie die Deckscheine in einen kritischen Punkttrockner und bedecken Sie sie mit 100% Ethanol. Drücken Sie dann den Netzschalter und öffnen Sie den Kohlendioxidtank.
Drücken Sie die Kühltaste etwa 30 Sekunden lang, bis die Temperatur auf null Grad Celsius sinkt. Drücken Sie dann die Fülltaste, bis eine Blase im Kammerfenster erscheint. Als nächstes drücken Sie die Spültaste, bis der Geruch von Ethanol aus dem Spülabgas verschwindet.
Drücken Sie dann erneut die Kühltaste, bis die Temperatur auf null Grad Celsius sinkt. Drücken Sie erneut die Voll- und Löschtasten, um sie auszuschalten. Schließen Sie dann den Kohlendioxidtank.
Drücken Sie erneut auf den kühlen Boden, um ihn auszuschalten, und drücken Sie dann die Heiztaste. Stellen Sie die Temperatur auf 42 Grad Celsius und den Druck auf 1.200 Pfund pro Quadratzoll ein. Sobald sich der Druck und die Temperatur stabilisiert haben, drücken Sie die Entlüftungstaste, damit der Druck langsam abnimmt.
Sobald der Kammerdruck 150 Pfund pro Quadratzoll erreicht hat, drücken Sie den Entlüftungsboden und warten Sie, bis der Druck auf null Pfund pro Quadratzoll sinkt. Schalten Sie den kritischen Punkttrockner aus und entfernen Sie die Deckgläser. Als nächstes montieren Sie mit Kohleklebehähnen die Deckgläser auf den Aluminiumprobenhalterungen für die Rasterelektronenmikroskopie und fahren dann mit der Sputterbeschichtung mit Gold oder Palladium in einem Sputtercoater fort.
Schalten Sie den Netzschalter des Sputtercoaters ein. Nachdem das Vakuum 30 Millitorr erreicht hat, spülen Sie die Kammer, um Feuchtigkeit und Luft zu entfernen, indem Sie den Gasschalter ausschalten und das Feingasventil gegen den Uhrzeigersinn drehen. Sobald das Vakuum auf 200 Millitorr ansteigt, schalten Sie den Gasschalter aus und warten Sie, bis das Vakuum 30 Millitorr erreicht.
Spülen Sie dann die Kammer erneut, um Feuchtigkeit und Luft wie gezeigt zu entfernen. Nachdem Sie die Kammer dreimal gespült haben, drücken Sie den Timerboden und stellen Sie den Spannungsregler ein, bis das Messgerät 10 Milliampere anzeigt. Entfernen Sie dann die beschichteten Deckgläser aus der Kammer.
Um die Membranrüschen zu visualisieren und zu quantifizieren, führen Sie die Probendeckel in die Kammer eines Rasterelektronenmikroskops ein, schließen Sie die Tür und drücken Sie die Evac-Taste. Öffnen Sie die Bediensoftware des Mikroskops und stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 15 Kilovolt und den Arbeitsabstand auf 10 Millimeter ein. Drücken Sie die Taste Koordinaten und bewegen Sie sich um den Controller herum, bis die Zellen in der Mitte des Beobachtungsbildschirms angezeigt werden.
Stellen Sie die Vergrößerung auf 3, 500 X ein und stellen Sie die Probe ab, indem Sie auf die Schaltfläche Foto klicken. Hier sind repräsentative Rasterelektronenmikroskopie-Bilder zu sehen, die die Bildung von Membranrüschen in rohen 264,7-Makrophagen nach Behandlung mit PMA und Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor zeigen. Die Vorbehandlung von Makrophagen mit dem Makropinozytose-Inhibitor EIPA dämpft die Bildung von Membranrüschen.
Während der Rüschenbildung durchläuft die Plasmamembran verschiedene morphologische Stadien, darunter einen blattartigen Membranvorsprung, eine C-förmige Membranrüsche und eine makropinozytäre Becher. Die Membranrüschenbildung nach PMA- und Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktorbehandlungen kann mittels Rasterelektronenmikroskopie quantifiziert werden, während die Makropinosomenbildung durch alternative bildgebende Verfahren wie konfokale Mikroskopie mit Texas Red Dextran und FM4-64 bestätigt werden kann. Die blauen Pfeile zeigen das Rüschen der Membran an, während die gelben und grünen Pfeile auf die Mikropinosomen zeigen.
Schließlich kann die Makropinozytose durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines fluoreszierenden Flüssigkeitsphasenmarkers wie FITC oder Texas Red Destran bestätigt und quantifiziert werden. Neben REM können auch Lebendzellbildgebung und Durchflusszytometrie-Analysen der fluoreszenzmarkierten Dextran-Internalisierung durchgeführt werden, um die Makropinozytose zu untersuchen und zu quantifizieren.
