Настоящий протокол визуализации SEM предоставляет инструмент для визуализации и количественной оценки образования мембранных оборок, круговых выступов и макропиноцитарных чашек на поверхности клетки in vitro. SEM обеспечивает изображения поверхности клеток с высоким разрешением, которые могут быть использованы для визуализации активности макропиноцитарной мембраны. Этот метод может быть использован для открытия новых сигнальных путей, регулирующих макропиноцитоз, и выявления новых стимуляторов и ингибиторов микропиноцитоза.
Начните с размещения стерильных стеклянных покровов в колодцах из 24-луночной пластины с использованием автоклавных щипцов. Затем семена сырых 264,7 макрофагов на крышку проскальзывают с плотностью от 10 до шестой клетки на миллилитр и инкубируют пластину в течение ночи в увлажненном инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день замените среду в каждой лунке 500 микролитрами свежей полной среды, затем предварительно обработайте макрофаги в течение 30 минут с помощью контроля транспортного средства, такого как DMSO, или ингибитора макропиноцитоза, такого как EIPA.
Затем, чтобы способствовать взъерошению мембраны, обработайте клетки в течение 30 минут стимуляторами макропиноцитоза, такими как одномикролярный раствор PMA или 100 нанограммов на миллилитр макрофагального колониестимулирующего фактора. Чтобы зафиксировать ячейки для сканирующей электронной микроскопии, аспирируют среду из скважин и дважды промывают крышку слипами с ледяным PBS, затем инкубируют крышку в фиксаторе в течение 30 минут при комнатной температуре с последующей ночной инкубацией при четырех градусах Цельсия. На следующий день, не нарушая клеточный монослой, аккуратно промыть и затем высиживать крышку на 500 микролитрах 0,1-моторного какодилата натрия в течение 15 минут.
После двух промывок 500 микролитрам дистиллированной воды промывайте крышку дважды в 500 микролитрах градуированной серии этанола с 10-минутной инкубацией в каждой промывке. Для выполнения сушки в критической точке поместите крышку в сушилку критической точки и накройте их 100% этанолом. Затем нажмите кнопку питания и откройте резервуар с углекислым газом.
Нажимайте кнопку охлаждения в течение примерно 30 секунд, пока температура не снизится до нуля градусов Цельсия. Затем нажимайте кнопку заполнения, пока в окне камеры не появится пузырь. Далее нажимаем кнопку продувки до тех пор, пока запах этанола из выхлопных газов продувки не исчезнет.
Затем нажмите кнопку охлаждения еще раз, пока температура не снизится до нуля градусов Цельсия. Повторно нажмите кнопки полного заполнения и очистки, чтобы отключить их. Затем закройте резервуар с углекислым газом.
Повторно нажмите на холодное дно, чтобы выключить его, затем нажмите кнопку нагрева. Установите температуру на 42 градуса Цельсия и давление на 1 200 фунтов на квадратный дюйм. Как только давление и температура стабилизируются, нажмите кнопку выпуска, чтобы давление медленно снижалось.
Как только давление в камере достигнет 150 фунтов на квадратный дюйм, нажмите на дно вентиляционного отверстия и подождите, пока давление не снизится до нуля фунтов на квадратный дюйм. Выключите сушилку в критической точке и удалите крышку. Затем, используя угольные клеевые краны, установите крышку на алюминиевые образцы креплений для сканирующей электронной микроскопии, затем приступайте к напылению покрытия с использованием золота или палладия в напыляющемся покрытии.
Включите кнопку питания напыляемого коатера. После того, как вакуум достигнет 30 миллиторров, промывайте камеру, чтобы удалить влагу и воздух, выключив газовый выключатель и повернув клапан тонкого газа против часовой стрелки. Как только вакуум увеличится до 200 миллиторр, выключите газовый выключатель и подождите, пока вакуум не достигнет 30 миллиторов.
Затем снова промыть камеру, чтобы удалить влагу и воздух, как показано на рисунке. После промывки камеры три раза нажмите на дно таймера и отрегулируйте ручку напряжения до тех пор, пока датчик не считывает 10 миллиампер. Затем снимите крышку с покрытием из камеры.
Чтобы визуализировать и количественно оценить оборки мембраны, вставьте крышку образца в камеру сканирующего электронного микроскопа, закройте дверцу и нажмите кнопку эвакуатора. Откройте операционное программное обеспечение микроскопа и установите ускоряющее напряжение на 15 киловольт, а рабочее расстояние на 10 миллиметров. Нажмите кнопку «Координаты» и перемещайтесь вокруг контроллера, пока ячейки не появятся в центре экрана наблюдения.
Установите увеличение на 3 500 X и создайте образец, нажав кнопку «Фото». Здесь показаны репрезентативные изображения сканирующей электронной микроскопии, демонстрирующие образование мембранных оборок в сырых макрофагах 264,7 после обработки PMA и макрофагальным колониестимулирующим фактором. Предварительная обработка макрофагов ингибитором макропиноцитоза EIPA ослабляет образование мембранных оборков.
Во время образования рюшей плазматическая мембрана подвергается различным морфологическим стадиям, включая листообразную мембранную протрузию, С-образную мембранную оборку и макропиноцитарную чашечку. Образование мембранных оборок после лечения PMA и макрофагов, стимулирующих колонии, может быть количественно определено с помощью сканирующей электронной микроскопии, тогда как образование макропиносом может быть подтверждено альтернативными методами визуализации, такими как конфокальная микроскопия с использованием техасского красного декстрана и FM4-64. Синие стрелки указывают на взъерошивание мембраны, в то время как желтые и зеленые стрелки указывают на микропиносомы.
Наконец, макропиноцитоз может быть подтвержден и количественно определен с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресцентного маркера фазы жидкости, такого как FITC или техасский красный декстран. В дополнение к SEM, визуализация живых клеток и анализ проточной цитометрии флуоресцентно меченой интернализации декстрана также могут быть выполнены для исследования и количественной оценки макропиноцитоза.
