Le protocole d’imagerie SEM actuel fournit un outil pour visualiser et quantifier la formation de volants membranaires, les protubérances circulaires et les coupes macropinocytaires à la surface de la cellule in vitro. SEM fournit des images haute résolution de la surface cellulaire qui peuvent être utilisées pour visualiser les activités de la membrane macropinocytaire. Cette technique peut être utilisée pour découvrir de nouvelles voies de signalisation régulant la macropinocytose et identifier de nouveaux stimulateurs et inhibiteurs de la micropinocytose.
Commencez par placer des glissières de couverture en verre stérile dans les puits d’une plaque de 24 puits à l’aide de pinces autoclavées. Ensuite, ensemencez 264,7 macrophages bruts sur la couverture glisse à une densité de 10 à la sixième cellule par millilitre et incubez la plaque pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez les milieux dans chaque puits par 500 microlitres de milieux complets frais, puis prétraitez les macrophages pendant 30 minutes avec un contrôle de véhicule tel que le DMSO ou un inhibiteur de macropinocytose tel que l’EIPA.
Ensuite, pour favoriser l’ébouriffement de la membrane, traitez les cellules pendant 30 minutes avec des stimulateurs de macropinocytose, tels qu’une solution de PMA à un micromolaire ou 100 nanogrammes par millilitre de facteur stimulant les colonies de macrophages. Pour fixer les cellules pour la microscopie électronique à balayage, aspirez le milieu des puits et lavez les feuillets de couverture deux fois avec du PBS glacé, puis incubez les glissements de couverture dans un fixateur pendant 30 minutes à température ambiante, suivie d’une incubation nocturne à quatre degrés Celsius. Le lendemain, sans déranger la monocouche cellulaire, lavez doucement puis incubez les feuillets de couverture dans 500 microlitres de cacodylate de sodium à 0,1 moteur pendant 15 minutes.
Après deux lavages avec 500 microlitres d’eau distillée, lavez les couvercles deux fois dans 500 microlitres d’une série d’éthanol gradué avec une incubation de 10 minutes à chaque lavage. Pour effectuer un séchage aux points critiques, placez les glissières de couverture dans un séchoir à points critiques et recouvrez-les d’éthanol à 100%. Ensuite, appuyez sur le bouton d’alimentation et ouvrez le réservoir de dioxyde de carbone.
Appuyez sur le bouton de refroidissement pendant environ 30 secondes jusqu’à ce que la température diminue à zéro degré Celsius. Ensuite, appuyez sur le bouton de remplissage jusqu’à ce qu’une bulle apparaisse dans la fenêtre de la chambre. Ensuite, appuyez sur le bouton de purge jusqu’à ce que l’odeur d’éthanol de l’échappement de purge disparaisse.
Ensuite, appuyez à nouveau sur le bouton de refroidissement jusqu’à ce que la température diminue à zéro degré Celsius. Appuyez à nouveau sur les boutons plein et purge pour les éteindre. Ensuite, fermez le réservoir de dioxyde de carbone.
Appuyez à nouveau sur le fond froid pour l’éteindre, puis appuyez sur le bouton de chauffage. Réglez la température à 42 degrés Celsius et la pression à 1 200 livres par pouce carré. Une fois la pression et la température stabilisées, appuyez sur le bouton de purge pour permettre à la pression de diminuer lentement.
Une fois que la pression de la chambre atteint 150 livres par pouce carré, appuyez sur le fond de l’évent et attendez que la pression diminue à zéro livre par pouce carré. Éteignez le séchoir à points critiques et retirez les glissières de couverture. Ensuite, à l’aide de robinets adhésifs au carbone, montez les glissières de couverture sur les supports d’échantillon en aluminium pour la microscopie électronique à balayage, puis procédez au revêtement de pulvérisation à l’aide d’or ou de palladium dans un enduit de pulvérisation.
Allumez le bouton d’alimentation de l’enduit de pulvérisation. Une fois que le vide atteint 30 millitorrs, rincez la chambre pour éliminer l’humidité et l’air en éteignant l’interrupteur à gaz et en tournant la vanne de gaz fin dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Une fois que le vide augmente à 200 millitorrs, éteignez l’interrupteur à gaz et attendez que le vide atteigne 30 millitorrs.
Ensuite, rincez à nouveau la chambre pour éliminer l’humidité et l’air comme démontré. Après avoir rincé la chambre trois fois, appuyez sur le fond de la minuterie et ajustez le bouton de tension jusqu’à ce que la jauge indique 10 milliampères. Ensuite, retirez les glissements de couverture enduits de la chambre.
Pour visualiser et quantifier les volants de la membrane, insérez les glissements du couvercle de l’échantillon dans la chambre d’un microscope électronique à balayage, fermez la porte et appuyez sur le bouton d’évacuation. Ouvrez le logiciel d’exploitation du microscope et réglez la tension d’accélération à 15 kilovolts et la distance de travail à 10 millimètres. Appuyez sur le bouton Coordonnées et déplacez-vous autour du contrôleur jusqu’à ce que les cellules apparaissent au centre de l’écran d’observation.
Réglez le grossissement sur 3 500 X et imagez l’échantillon en cliquant sur le bouton Photo. Voici des images représentatives de microscopie électronique à balayage, démontrant la formation de volants membranaires dans 264,7 macrophages bruts après traitement par PMA et facteur de stimulation des colonies de macrophages. Le prétraitement des macrophages avec l’inhibiteur de macropinocytose EIPA atténue la formation de volants membranaires.
Au cours de la formation des volants, la membrane plasmique subit des étapes morphologiques distinctes, notamment une saillie membranaire en forme de feuille, un volant membranaire en forme de C et une coupe macropinocytaire. La formation de volants membranaires après des traitements de facteur de stimulation des colonies de PMA et de macrophages peut être quantifiée à l’aide de la microscopie électronique à balayage, tandis que la formation de macropinosomes peut être confirmée par d’autres techniques d’imagerie, telles que la microscopie confocale utilisant le dextran rouge du Texas et FM4-64. Les flèches bleues indiquent des volants de membrane, tandis que les flèches jaunes et vertes pointent vers les micropoinosomes.
Enfin, la macropinocytose peut être confirmée et quantifiée par cytométrie en flux à l’aide d’un marqueur de phase fluide fluorescent tel que le FITC ou le dextran rouge du Texas. En plus de la MEB, l’imagerie des cellules vivantes et l’analyse par cytométrie en flux de l’internalisation de la dextran marquée par fluorescence peuvent également être effectuées pour étudier et quantifier la macropinocytose.
