El método de inmersión manual descrito aquí es un método rentable y confiable para preparar muestras para microscopía electrónica de transmisión. En este video, demostraremos cómo configurar el émbolo manual, preparar criógenos y realizar borrados y hundimientos manuales de rejillas EM. Prepare el entorno de inmersión manual.
Este procedimiento debe realizarse en una cámara frigorífica mantenida a 40 grados centígrados con una humedad superior al 95%Recomendamos utilizar los materiales que se muestran aquí y como se describe en el protocolo en línea para el secado y la inmersión manual. Prepara el criógeno Dewar y el émbolo manual. Para ensamblar el criógeno Dewar, primero instale la base de la plataforma en la parte inferior de la espuma de poliestireno azul Dewar, asegurándose de que sea plana y nivelada.
Luego coloque el soporte del recipiente de etano en la parte superior de la base de la plataforma e inserte el recipiente de etano de latón. Finalmente, sitúe la plataforma de almacenamiento de la red giratoria. A continuación, ubique el Dewar que se hunde en la base del émbolo manual.
Centra el recipiente de etano debajo del brazo que se hunde y asegura el Dewar que se hunde a la base. Para ajustar la altura de inmersión manual, primero coloque cinta nueva en la base del brazo de inmersión. A continuación, sujete un par de pinzas de sujeción envolviendo de forma segura la cinta alrededor del brazo de inmersión y la base de la pinza.
Asegúrese de que las pinzas estén firmemente unidas golpeándolas ligeramente. Sostenga el brazo que se hunde y baje lentamente las pinzas en el recipiente de etano de latón presionando el pedal. Ajuste la ubicación del Dewar que se hunde para que las pinzas se ubiquen en el centro del recipiente de etano de latón.
Las puntas de las pinzas no deben entrar en contacto con el tamaño o el fondo del recipiente de etano de latón para evitar daños en las pinzas y el émbolo manual. Una vez que se haya establecido la posición, restablezca el brazo de inmersión manual. Preparar el criógeno.
La preparación de criógenos debe realizarse en una habitación bien ventilada y se debe usar el equipo de protección personal adecuado en todo momento. Para empezar, el nitrógeno líquido pobre directamente en el Dewar que se hunde, deteniéndose cuando el nivel de nitrógeno líquido alcanza la parte superior del recipiente de etano de latón. El sistema debe estar lo suficientemente frío como para continuar después de que el nitrógeno líquido deje de burbujear violentamente.
Esto tomará aproximadamente cinco minutos. El etano viene como un gas comprimido y necesita ser condensado. Para ajustar el flujo de gas para una condensación óptima de etano, inserte la punta de la línea de gas etano en un vaso de agua de 250 mil millas y observe el burbujeo.
El flujo de gas debe producir un flujo constante de burbujas que no interrumpa violentamente la superficie del agua. Para comenzar a condensar etano, coloque la punta de la línea de gas etano en la parte inferior del recipiente de etano de latón. Revuelva lentamente la punta de metal y comience a licuar el etano.
Tan pronto como el etano comience a enfriarse, hará un ruido audible. Llene el recipiente de etano de latón hasta tres cuartos lleno de etano líquido. Rellene el Dewar sumergido con nitrógeno líquido, asegurándose de que toque el recipiente de etano de latón pero no se derrame en él.
La adición de nitrógeno líquido es necesaria para la congelación uniforme del etano. Coloque la tapa de espuma en el Dewar azul y permita que el etano se solidifique por completo. Reinicie el flujo de gas etano y coloque cuidadosamente la punta de la línea de gas en el etano sólido.
Es importante colocar la punta verticalmente en el recipiente y dispensar etano en la parte inferior. Revuelva lentamente la punta de metal para derretir el etano y lleve el nivel de etano líquido hasta la parte superior del recipiente. Cierre la tapa durante aproximadamente un minuto y permita que el etano se solidifique alrededor de los bordes del recipiente de latón hasta que se vean de dos a tres milímetros de etano sólido.
El etano está ahora a una temperatura ideal para congelar muestras biológicas. Fije el Dewar hundido con cuidado a la base del émbolo manual. Sujete un par de pinzas de sujeción envolviendo de forma segura la cinta alrededor del brazo de inmersión y la base de la pinza.
Sostenga el brazo que se hunde y baje lentamente las pinzas en el etano líquido presionando el pedal. Ajuste la ubicación del Dewar de inmersión para que las pinzas se ubiquen en el medio del etano líquido, evitando el contacto con el anillo de etano sólido. Preparar materiales y accesorios de inmersión.
Prepare el papel secante cortando cada papel de filtro circular en tiras de aproximadamente un centímetro de ancho. Evite tocar el centro del papel secante y deseche las piezas finales más pequeñas. Es importante asegurarse de que las tiras de papel secante estén secas, limpias y libres de contaminantes.
Antes de sumergirse, coloque las cajas de rejilla en el Dewar sumergido en las ranuras adecuadas. Asegúrese de que la rejilla cubra nuestro libre para girar. Prepare especímenes de CryoEM por congelación por inmersión.
Debido a la diversidad de preparaciones de la cuadrícula y la red, siga los protocolos recomendados para hacer que las rejillas sean hidrófilas. Para manejar adecuadamente las rejillas, use pinzas de sujeción limpias y secas para recoger las rejillas hidrofílicas en el anillo exterior. Deslice la abrazadera de plástico para asegurar la rejilla y golpee las pinzas suavemente para asegurarse de que la rejilla esté correctamente sujeta.
Aplique tres microlitros de muestra en la parte frontal de la rejilla sostenida en las pinzas de sujeción. Fije las pinzas firmemente al brazo de inmersión manual envolviendo la cinta alrededor de la base de la pinza. La muestra ya está lista para ser borrada y sumergida congelada.
Sostenga cada extremo de una tira limpia de papel secante entre los dedos índice y los pulgares. Apoya tus manos en el borde del Dewar para establecer una posición estable. El papel secante debe estar aproximadamente a un centímetro de la superficie de la rejilla.
Doble el papel secante hasta que el centro entre en contacto con la rejilla. Es importante que el papel secante sea paralelo a la superficie de la rejilla para permitir un contacto uniforme y evitar daños en la rejilla. Cuando el frente líquido móvil deje de extenderse, comience a contar.
Borra la cuadrícula durante cinco segundos. Separe los dedos, forzando el papel secante y retirándolo rápidamente de la superficie de la rejilla. Simultáneamente, presione el pedal para soltar el brazo de inmersión manual, sumergiendo las pinzas que sostienen la rejilla en el etano líquido.
Manteniendo la rejilla recién congelada en el etano líquido, separe cuidadosamente las pinzas del brazo de inmersión manual. Desenganche cuidadosamente las pinzas para que la rejilla sea extraíble. Mueva la rejilla hacia el depósito de nitrógeno líquido debajo del recipiente de etano de latón con un movimiento rápido desde el etano hasta el nitrógeno líquido.
Coloque la cuadrícula en el cuadro de cuadrícula. Resultados representativos. A partir de este video, los investigadores deberían poder preparar rejillas CryoEM, como esta, con muchos cuadrados que contienen películas delgadas de hielo vítreo para imágenes de alta resolución.
La concentración de la muestra y el tiempo de borrado se pueden ajustar para optimizar la densidad de partículas. Aquí, demostraremos el flujo de trabajo completo para congelar muestras cryoEM utilizando el método de borrado y inmersión. Use una pinza de sujeción limpia para recoger una rejilla nueva y asegurar la rejilla en su lugar.
Aplique tres microlitros de muestra en el lado hidrófilo de la rejilla y asegure las pinzas al brazo de inmersión manual envolviendo la cinta alrededor del mango de la pinza. Coloque el papel secante paralelo a la superficie de la rejilla y doble suavemente el papel secante hacia la rejilla para iniciar el borrado. Después de la cantidad de tiempo deseada, mueva el papel secante en un movimiento de chasquido lejos de la superficie de la rejilla mientras presiona el pedal para liberar el brazo que se hunde, sumergiendo la rejilla en el etano líquido.
Desenrolle con cuidado la cinta alrededor de las pinzas y el brazo de inmersión manual. Con un movimiento rápido, transfiera rápidamente la rejilla desde el recipiente de etano al depósito de nitrógeno líquido. Coloque la rejilla en la caja de almacenamiento de la rejilla y envuelva las pinzas en una toallita Kim para que se sequen; repita.
