여기에 설명된 수동 플런징 방법은 전송 전자 현미경 검사법을 위한 시료를 준비하기 위한 비용 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 비디오에서는 수동 플런저를 설정하고 극저온을 준비하고 EM 그리드의 수동 블로팅 및 급락을 수행하는 방법을 시연합니다. 수동 급락 환경을 준비합니다.
이 절차는 습도가 섭씨 40도 이상으로 유지되는 차가운 방에서 수행해야하며 여기에 표시된 재료를 사용하는 것이 좋습니다. 저온 드워와 수동 플런저를 준비합니다. 저온 드와르를 조립하려면 먼저 파란색 스티로폼 드와르 의 바닥에 플랫폼 베이스를 설치하여 평평하고 평평한 지 확인합니다.
그런 다음 에탄 용기 홀더를 플랫폼 베이스 위에 놓고 황동 에탄 용기를 삽입합니다. 마지막으로 회전 그리드 스토리지 플랫폼을 배치합니다. 다음으로, 급락 하는 데와르 수동 플런저의 기지에 찾을 수 있습니다.
에탄 선박을 급락팔 아래에 중앙으로 고정하고 급락하는 드와르를 기지로 고정시한다. 수동 플런징 높이를 설정하려면 먼저 급락 하는 팔의 베이스에 신선한 테이프를 연결 합니다. 다음으로, 플런징 암과 트위저 베이스 주위에 테이프를 단단히 감싸서 클램핑 핀셋 을 고정합니다.
핀셋을 가볍게 눌러 단단히 부착되었는지 확인하십시오. 급락하는 팔을 잡고 발 페달을 우울하게 하여 핀셋을 황동 에탄 용기로 천천히 낮춥니다. 핀셋이 황동 에탄 용기의 중간에 위치하도록 급락 데와르의 위치를 조정합니다.
핀셋의 끝은 핀셋과 수동 플런저의 손상을 피하기 위해 황동 에탄 용기의 크기 또는 바닥에 접촉해서는 안됩니다. 위치가 설정되면 수동 플런징 암을 재설정합니다. 극저온을 준비합니다.
극저온 제제는 통풍이 잘 되는 방에서 수행해야 하며 적절한 개인 보호 장비는 항상 착용해야 합니다. 먼저 액체 질소가 급락하는 데와르로 직접 들어가면 액체 질소 수준이 황동 에탄 용기의 상단에 도달하면 멈춥니다. 액체 질소가 격렬하게 버블링중지 한 후 진행할 만큼 시스템이 차가워야 합니다.
이 경우 약 5분이 소요됩니다. 에단은 압축 가스로 제공되며 응축될 필요가 있습니다. 최적의 에탄 응축을 위해 가스 흐름을 설정하려면 에탄 가스 라인의 끝을 250 마일 의 물 비커에 삽입하고 버블링을 관찰하십시오.
가스 흐름은 물의 표면을 격렬하게 방해하지 않는 기포의 꾸준한 흐름을 생성해야합니다. 에탄 응축을 시작하려면 황동 에탄 용기의 바닥에 에탄 가스 라인의 끝을 놓습니다. 금속 끝을 천천히 저어서 에탄을 액화하기 시작합니다.
에탄이 식히기 시작하자마자 들리는 소리가 납니다. 황동 에탄 용기는 액체 에탄으로 가득 찬 3 쿼터로 채웁니다. 액체 질소로 급락하는 데와르를 위로 얹어 황동 에탄 용기에 닿지만 그 안에 흘러들어가지 않도록 합니다.
균일 한 에탄 동결에 액체 질소의 첨가가 필요합니다. 거품 뚜껑을 파란색 으로 떨어지면 데와르가 완전히 굳어지도록 합니다. 에탄 가스 흐름을 다시 시작하고 가스 라인의 끝을 고체 에탄에 조심스럽게 놓습니다.
팁을 용기에 수직으로 배치하고 바닥에 에탄을 분배하는 것이 중요합니다. 금속 끝을 천천히 저어 에탄을 녹이고 액체 에탄의 수준을 용기 의 상단까지 가져옵니다. 뚜껑을 약 1분간 닫고 에탄이 황동 용기의 가장자리 주위에 고화되어 2~3밀리미터의 고체 에탄이 보일 때까지 응고할 수 있습니다.
에탄은 이제 생물학적 샘플을 동결하는 데 이상적인 온도에 있습니다. 급락하는 데와르를 수동 플런저 의 베이스에 조심스럽게 부착합니다. 플런징 암과 트위저 베이스 주위에 테이프를 단단히 감싸서 클램핑 핀셋 을 고정합니다.
플런징 팔을 잡고 발 페달을 우울하게 하여 핀셋을 액체 에탄으로 천천히 낮춥니다. 핀셋이 액체 에탄의 중간으로 위치하도록 급락 데와르의 위치를 조정하여 고체 에탄 링과의 접촉을 피하십시오. 급락 재료 및 액세서리를 준비합니다.
각 원형 필터 용지를 약 1센티미터 너비의 스트립으로 절단하여 얼룩질 용지를 준비합니다. 얼룩진 용지의 중앙을 만지지 말고 작은 끝 조각을 버리십시오. 얼룩진 종이 스트립이 건조하고 깨끗하며 오염 물질이 없는지 확인하는 것이 중요합니다.
급락하기 전에 그리드 박스를 급락하는 데와르에 배치하여 적절한 슬롯에 넣습니다. 그리드가 자유롭게 회전할 수 있도록 보장합니다. 급락 동결에 의해 CryoEM 표본을 준비합니다.
그리드 및 그리드 준비의 다양성으로 인해 그리드 친수성 렌더링을 위한 권장 프로토콜을 따릅니다. 그리드를 제대로 처리하려면 깨끗하고 건조한 클램핑 핀셋을 사용하여 외부 링에서 친수성 그리드를 선택합니다. 플라스틱 클램프를 밀어 그리드를 고정하고 핀셋을 부드럽게 눌러 그리드가 제대로 고정되도록 합니다.
클램핑 핀셋에 보관된 그리드 의 전면에 3개의 마이크로리터 샘플을 적용합니다. 핀셋을 핀셋을 핀셋 베이스 주위에 테이프를 감싸서 수동 플런징 암에 단단히 부착합니다. 샘플은 이제 블롭고 얼어 붙을 준비가 되었습니다.
검지 손가락과 엄지 손가락 사이에 깨끗한 얼룩장의 깨끗한 스트립의 각 끝을 누십시오. 안정된 위치를 확립하기 위해 급락 데와르의 가장자리에 손을 휴식. 블로팅 용지는 그리드 표면에서 약 1cm여야 합니다.
중심이 그리드에 닿을 때까지 블로팅 용지를 구부립니다. 블로팅 용지는 그리드 표면과 평행하여 접촉도 허용하고 그리드 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 이동식 액체 전면이 확산을 멈추면 계산을 시작합니다.
그리드를 5초 동안 블롯합니다. 손가락을 떼어 내고, 얼룩지는 용지를 긴장시키고, 격자 표면에서 빠르게 제거합니다. 동시에, 발 페달을 눌러 수동 급락 팔을 해제하여 그리드를 액체 에탄으로 잡고 있는 핀셋을 떨어놓습니다.
액체 에탄에 갓 냉동 그리드를 유지, 조심스럽게 수동 급락 팔에서 핀셋을 분리. 핀셋을 조심스럽게 고정 해제하여 그리드를 분리할 수 있습니다. 에탄에서 액체 질소로 의 한 번의 신속한 움직임으로 황동 에탄 용기 아래액체 질소 저장소로 그리드를 이동합니다.
그리드 상자에 그리드를 배치합니다. 대표적인 결과. 이 비디오에서 연구원들은 고해상도 이미징을 위해 유리체 얼음의 박막을 포함하는 많은 사각형으로 CryoEM 그리드를 준비할 수 있어야 합니다.
샘플 농도 및 블로팅 시간을 조정하여 입자 밀도를 최적화할 수 있습니다. 여기서는 블롯 및 플런지 방법을 사용하여 CryoEM 샘플을 동결하기 위한 전체 워크플로우를 시연합니다. 깨끗한 클램핑 트위저를 사용하여 신선한 그리드를 선택하고 그리드를 제자리에 고정하십시오.
그리드의 친수성 측에 3개의 마이크로리터를 적용하고 트위저 손잡이 주위에 테이프를 감싸서 수동 플런징 암에 핀셋을 고정합니다. 블로팅 용지를 그리드 표면에 평행하게 배치하고 블로팅 용지를 그리드쪽으로 부드럽게 구부려 블로팅을 시작합니다. 원하는 시간 후, 블로팅 용지를 그리드 표면에서 멀리 스냅 모션으로 이동하면서 발 페달을 누르고 뛰어내리는 팔을 방출하고 그리드를 액체 에탄으로 떨어뜨림부합니다.
핀셋 주위와 수동 플런징 팔 주위에서 테이프를 조심스럽게 풀어. 하나의 신속한 움직임으로 에탄 용기에서 액체 질소 저장소로 그리드를 신속하게 전송합니다. 그리드 저장 상자에 그리드를 놓고 핀셋을 김지우에 싸서 건조시로 감싸십시오.
