Описанный здесь метод ручного погружения является экономически эффективным и надежным методом подготовки образцов для просвечивающей электронной микроскопии. В этом видео мы продемонстрируем, как настроить ручной плунжер, подготовить криоген и выполнить ручное промокание и погружение электромагнитных сетей. Подготовьте ручную среду погружения.
Эта процедура должна выполняться в холодном помещении, поддерживаемом при температуре 40 градусов цельсия с влажностью более 95% Мы рекомендуем использовать материалы, показанные здесь и как описано в онлайн-протоколе для ручного промокания и погружения. Подготовьте криоген Дьюара и ручной плунжер. Чтобы собрать криоген Дьюара, сначала установите основание платформы в нижней части синего пенопласта Дьюара, убедившись, что оно плоское и ровное.
Затем поместите держатель этанового сосуда поверх основания платформы и вставьте латунный сосуд с этаном. Наконец, расположите вращающуюся сетевую платформу для хранения. Затем найдите погружающийся Дьюар к основанию ручного плунжера.
Центрируйте этановый сосуд ниже погружающегося рычага и закрепите погружающегося Дьюара на базу. Чтобы установить ручную высоту погружения, сначала прикрепите свежую ленту к основанию погружающего рычага. Затем закрепите пару зажимных пинцетов, надежно обернув ленту вокруг погружающего рычага и основания пинцета.
Убедитесь, что пинцет прочно прикреплен, слегка постукивая по ним. Удерживайте погружающуюся руку и медленно опустите пинцет в латунный этановый сосуд, нажав на ножную педаль. Отрегулируйте расположение погружающегося Дьюара так, чтобы пинцет располагался к середине латунного этанового сосуда.
Наконечники пинцета не должны соприкасаться с размером или дном латунного этанового сосуда, чтобы избежать повреждения пинцета и ручного плунжера. После того, как положение установлено, сбросьте ручной погружной рычаг. Подготовьте криоген.
Подготовка криогена должна проводиться в хорошо проветриваемом помещении, а соответствующие средства индивидуальной защиты должны постоянно носиться. Для начала бедный жидкий азот непосредственно попадает в погружающийся Дьюар, останавливаясь, когда уровень жидкого азота достигает вершины латунного этанового сосуда. Система должна быть достаточно холодной, чтобы продолжать работу после того, как жидкий азот перестанет бурлить.
Это займет примерно пять минут. Этан поступает в виде сжатого газа и нуждается в конденсации. Чтобы установить поток газа для оптимальной конденсации этана, вставьте наконечник газовой линии этана в стакан воды на 250 мил и наблюдайте за бурлением.
Поток газа должен производить устойчивый поток пузырьков, который не нарушает бурно поверхность воды. Чтобы начать конденсацию этана, поместите наконечник газопровода этана на дно латунного этанового сосуда. Медленно перемешайте металлический наконечник и начните разжижать этан.
Как только этан начнет остывать, он издаст слышимый шум. Наполните латунный этановый сосуд до трех четвертей, заполненных жидким этаном. Дополните погружающийся Дьюар жидким азотом, следя за тем, чтобы он касался латунного этанового сосуда, но не пролился в него.
Добавление жидкого азота необходимо для равномерного замораживания этана. Поместите пенную крышку на синий погружающийся Дьюар и дайте этану полностью затвердеть. Перезапустите поток газа этана и осторожно поместите наконечник газовой магистрали в твердый этан.
Важно поместить наконечник вертикально в сосуд и дозировать этан на дно. Медленно перемешайте металлический наконечник, чтобы расплавить этан и довести уровень жидкого этана до верхней части сосуда. Закройте крышку примерно на одну минуту и дайте этану затвердеть по краям латунного сосуда до тех пор, пока не будет видно два-три миллиметра твердого этана.
Этан в настоящее время находится при температуре, идеально подходящей для замораживания биологических образцов. Аккуратно прикрепите погружной Дьюар к основанию ручного плунжера. Закрепите пару зажимных пинцетов, надежно обернув ленту вокруг погружающего рычага и основания пинцета.
Удерживайте погружающуюся руку и медленно опустите пинцет в жидкий этан, нажав на ножную педаль. Отрегулируйте расположение погружающегося Дьюара так, чтобы пинцет располагался к середине жидкого этана, избегая контакта с твердым этановым кольцом. Подготовьте погружные материалы и аксессуары.
Подготовьте промокательную бумагу, разрезав каждую круглую фильтровальную бумагу на полоски шириной около одного сантиметра. Избегайте прикосновения к центру промокательной бумаги и отбросьте меньшие концевые кусочки. Важно убедиться, что полоски промокательной бумаги являются сухими, чистыми и свободными от загрязнений.
Перед погружением поместите коробки сетки в погружающийся Дьюар в соответствующие слоты. Убедитесь, что сетка покрывает нашу свободную ротацию. Подготовьте образцы CryoEM методом погружной заморозки.
В связи с разнообразием сетки и подготовки сетки, следуйте рекомендуемым протоколам для придания сеткам гидрофильной. Чтобы правильно обращаться с сетками, используйте чистый, сухой зажимной пинцет, чтобы подобрать гидрофильные решетки на внешнем кольце. Сдвиньте пластиковый зажим, чтобы закрепить сетку, и осторожно постучите пинцетом, чтобы убедиться, что сетка правильно зажата.
Нанесите три микролитра образца на переднюю часть сетки, удерживаемой в зажимном пинцете. Плотно прикрепите пинцет к ручному погружному рычагу, обернув ленту вокруг основания пинцета. Теперь образец готов к смачиванию и погружению в замороженное состояние.
Держите каждый конец чистой полоски промокательной бумаги между указательными и большими пальцами. Положите руки на край погружающегося Дьюара, чтобы установить стабильное положение. Промокательная бумага должна находиться примерно в одном сантиметре от поверхности сетки.
Согните промокательную бумагу до тех пор, пока центр не соприкоснется с сеткой. Важно, чтобы промокательная бумага была параллельна поверхности сетки, чтобы обеспечить равномерный контакт и предотвратить повреждение сетки. Когда подвижный жидкий фронт перестанет распространяться, начинайте подсчет.
Промокните сетку в течение пяти секунд. Раздвиньте пальцы, напрягая промокательную бумагу и быстро снимая ее с поверхности сетки. Одновременно нажмите ножную педаль, чтобы отпустить ручной погружной рычаг, погружая пинцет, удерживающий сетку, в жидкий этан.
Удерживая свежезамороженную сетку в жидком этане, тщательно отсоедините пинцет от ручного погружного рычага. Осторожно отсоедините пинцет, чтобы сетка была съемной. Переместите сетку в резервуар жидкого азота под латунным этановым сосудом одним быстрым движением от этана к жидкому азоту.
Поместите сетку в поле сетки. Репрезентативные результаты. Из этого видео исследователи должны быть в состоянии подготовить сетки CryoEM, такие как этот, со многими квадратами, содержащими тонкие пленки стекловидного льда для изображения с высоким разрешением.
Концентрация образца и время промокания могут быть отрегулированы для оптимизации плотности частиц. Здесь мы продемонстрируем полный рабочий процесс замораживания образцов CryoEM с использованием метода blot and plunge. Используйте чистый зажимной пинцет, чтобы подобрать свежую сетку и закрепить сетку на месте.
Нанесите три микролитра образца на гидрофильную сторону сетки и закрепите пинцет на ручном погружном рычаге, обернув ленту вокруг ручки пинцета. Расположите промокательную бумагу параллельно поверхности сетки и осторожно согните промокательную бумагу по направлению к сетке, чтобы начать промокание. По истечении нужного количества времени переместите промокательную бумагу в отрыв от поверхности сетки, одновременно нажимая на ножную педаль, чтобы освободить погружающуюся руку, погружая сетку в жидкий этан.
Осторожно размотайте ленту вокруг пинцета и ручного погружающего рычага. Одним быстрым движением быстро перенесите сетку из этанового сосуда в резервуар жидкого азота. Поместите сетку в ящик для хранения сетки и оберните пинцет в салфетку Kim Wipe для высыхания; повторите.
