La técnica peel-blot permite la separación de muestras crio-EM biológicas concentradas y de múltiples capas en capas individuales para reducir el grosor, aumentar la concentración y facilitar el procesamiento de imágenes. Las concentraciones de muestra se pueden aumentar antes de la preparación de la rejilla, y el peel-blot se puede ajustar para dar como resultado una distribución densa de muestras de una sola capa para una recopilación de datos altamente eficiente. Para comenzar, apile dos piezas de papel de filtro de tamaño de poro de 20-25 micrómetros y coloque una película de parafina larga adyacente a ella con el papel hacia arriba.
Coloque un trozo de papel de filtro submicrónico encima de dos trozos adicionales de papel de filtro. Coloque las pinzas anticapilares con la pierna doblada hacia arriba y la pierna recta hacia abajo y seleccione una rejilla de malla 600 con el lado liso o brillante hacia arriba. Coloque las pinzas sobre una placa de Petri u otra superficie elevada para evitar el contacto de la rejilla limpia con otros elementos.
Retire el papel de la película de parafina y tire de los lados para crear un pequeño borde. Pipetear dos gotas de 150 microlitros, por lo que la solución de trehalosa al 4% a aproximadamente uno o dos centímetros de un lado corto de la película de parafina. Las dos gotas deben estar separadas por alrededor de un centímetro.
Luego, en un banco separado o en el piso, vierta nitrógeno líquido en un pequeño recipiente de espuma de poliestireno y coloque un pequeño recipiente de rejilla crio-EM en el nitrógeno líquido. Cubra el recipiente de espuma de poliestireno con toallitas sin pelusa. Para hacer flotar la película de carbono de la mica, use Dumont 5 Fórceps y toque un lado de la mica en un ligero ángulo hacia abajo en una de las gotas de solución de trehalosa.
Mueva la mica hacia abajo para permitir que la tensión del agua levante la película de carbono lentamente. Libere la mica una vez que la película de carbono flote en la superficie de la gota. Inspeccione visualmente la película de carbono para evitar el uso de carbono con daños en forma de fracturas.
Inserte la rejilla sujeta por las pinzas anticapilares en un ángulo de 20-30 grados en una gota de trehalosa en una posición adyacente y luego centre la rejilla debajo de la película de carbono. Recoge la película de carbono, mantén la rejilla en la misma orientación y baja lentamente la rejilla sobre la superficie de la segunda gota de trehalosa sin romper la tensión superficial de la gota. Esto eliminará la película de carbono innecesaria que puede haberse envuelto alrededor del borde de la rejilla hacia el lado áspero.
Gire las pinzas anticapilares y colóquelas en una placa de Petri con el lado de carbono de la rejilla hacia abajo. Pipetear 1,3 microlitros de la muestra en el ligero menisco trehalosa en la parte superior de la rejilla. Luego, pipetear la solución aproximadamente 8-10 veces para mezclar y distribuir la trehalosa y la muestra en ambos lados de la rejilla.
Pipetear una o más gotas de 1,7 microlitros de solución de trehalosa sobre la película de parafina mientras se incuba la solución de trehalosa de muestra en la rejilla durante un minuto. Gire la rejilla a su posición original con la película de carbono hacia arriba y presione la rejilla sobre el papel de filtro submicrónico con las pinzas anticapilares. Una vez que la solución haya sido absorbida por el papel de filtro y la película de carbono esté plana, espere tres segundos antes de levantar la rejilla y moverla verticalmente sobre la gota de 1,7 microlitros de solución de trehalosa.
Estos pasos se pueden repetir entre una y tres reiteraciones o más, dependiendo de la muestra. Seque la rejilla en los dos trozos de papel de filtro y luego levante la rejilla del papel de filtro. Después de aproximadamente 13 segundos, dependiendo de la humedad y el tampón de muestra, sumerja la rejilla en el nitrógeno líquido en el recipiente pequeño de espuma de poliestireno y colóquelo en el recipiente de rejilla crio-EM o transfiéralo directamente para el cribado crio-EM o la recopilación de datos.
Aquí se muestra una muestra de cristal 2D de leucotrieno C4 sintasa humana sometida al método peel-blot. La región a la izquierda de la flecha se redujo en gran medida a cristales 2D de una sola capa en una región de contacto entre la película de carbono y la barra de rejilla que se borró y luego se desplazó. La región a la derecha de la flecha no se vio afectada por la mancha de cáscara.
La mitad inferior de la imagen representa las regiones con grandes bicapas de fosfolípidos de una sola capa, en su mayoría de una sola capa, resultantes de la aplicación de la mancha de cáscara. La mitad superior no estaba en una zona de contacto entre la barra de rejilla y la película de carbono, y por lo tanto contenía liposomas completos con dos bicapas de fosfolípidos. El cuadrado de cuadrícula de una cuadrícula de malla 400 muestra la huella de la barra de cuadrícula y las regiones resultantes borradas de cáscara, así como las regiones que no estuvieron en contacto con una barra de cuadrícula o sometidas a menos iteraciones de borrado de cáscara.
Estas imágenes mostraron la secación de una rejilla EM preparada por la inyección posterior en un papel de filtro submicrónico utilizando una película de carbono muy delgada. Las imágenes son fotogramas individuales en contacto inicial con la membrana, 1.000 milisegundos después del contacto y 2.000 milisegundos después del contacto. La flecha indica cuadrados de cuadrícula donde la presión capilar rompió la película de carbono.
Evitar fracturas en la película de carbono y combinar papel de filtro submicrónico con una gota de trehalosa de 1,7 microlitros para succionar y luego separar las capas son pasos clave. Las muestras borradas se utilizan para la recopilación de datos crio-EM de alta resolución, seguida del procesamiento de imágenes para la determinación de la estructura. El peel-blot permite la determinación estructurada de cristales 2D de proteína de una sola capa que anteriormente eran demasiado gruesos para crio-EM.
Además, puede concentrar varias muestras en capas individuales en una película de carbono.
