O método manual de mergulho descrito aqui é um método econômico e confiável para preparar amostras para a microscopia eletrônica de transmissão. Neste vídeo, demonstraremos como configurar o êmbolo manual, preparar criogen e executar manchas manuais e mergulhos de grades EM. Prepare o ambiente manual de mergulho.
Este procedimento deve ser realizado em uma sala fria mantida a 40 graus Celsius com umidade superior a 95% Recomendamos o uso dos materiais aqui mostrados e conforme descrito no protocolo online para manchas e mergulhos manuais. Prepare o criogen Dewar e o êmbolo manual. Para montar o criogen Dewar, primeiro instale a base de plataforma na parte inferior do isopor azul Dewar, garantindo que ele seja plano e nivelado.
Em seguida, coloque o suporte do vaso de etano em cima da base da plataforma e insira o vaso de etano de latão. Por fim, sitia a plataforma de armazenamento da grade giratória. Em seguida, localize o Dewar mergulhando na base do êmbolo manual.
Centralizar o vaso de etano abaixo do braço mergulhando e proteger o Dewar mergulhando para a base. Para definir a altura manual, primeiro conecte fita fresca à base do braço mergulhador. Em seguida, aperte um par de pinças de fixação, envolvendo firmemente a fita ao redor do braço mergulhando e a base da pinça.
Certifique-se de que as pinças estão firmemente presas tocando-as levemente. Segure o braço mergulhando e baixe lentamente a pinça no recipiente de etano de latão, deprimindo o pedal do pé. Ajuste a localização do Dewar mergulhando para que as pinças se localizem no meio do vaso de etano de latão.
As pontas das pinças não devem entrar em contato com o tamanho ou a parte inferior do vaso de etano de latão para evitar danos à pinça e ao êmbolo manual. Uma vez definida a posição, reinicie o braço de mergulho manual. Prepare o Criogen.
A preparação criogena deve ser realizada em uma sala bem ventilada e equipamentos de proteção individual adequados devem ser usados o tempo todo. Para começar, nitrogênio líquido pobre diretamente no Dewar mergulhando, parando quando o nível de nitrogênio líquido atinge o topo do vaso de etano de latão. O sistema deve ser frio o suficiente para prosseguir depois que o nitrogênio líquido parar de borbulhar violentamente.
Isso levará aproximadamente cinco minutos. O etano vem como um gás comprimido e precisa ser condensado. Para definir o fluxo de gás para condensação ideal de etano, insira a ponta da linha de gás etano em um béquer de 250 mil béquer de água e observe o borbulhante.
O fluxo de gás deve produzir um fluxo constante de bolhas que não perturbam violentamente a superfície da água. Para começar a condensar o etano, coloque a ponta da linha de gás etano no fundo do vaso de etano de latão. Mexa lentamente a ponta metálica e comece a liquefazer o etano.
Assim que o etano começar a esfriar, ele vai fazer um barulho audível. Encha o recipiente de etano de latão para três quartos cheio de etano líquido. Cubra o Dewar mergulhando com nitrogênio líquido, garantindo que ele toque o vaso de etano de latão, mas não derrame nele.
A adição de nitrogênio líquido é necessária para o congelamento uniforme de etano. Coloque a tampa de espuma sobre o Dewar mergulhando azul, e deixe o etano solidificar completamente. Reinicie o fluxo de gás etano e coloque cuidadosamente a ponta da linha de gás no etano sólido.
É importante colocar a ponta verticalmente no vaso e distribuir etano na parte inferior. Mexa lentamente a ponta metálica para derreter o etano e leve o nível de etano líquido até o topo do vaso. Feche a tampa por aproximadamente um minuto e deixe que o etano solidifique ao redor das bordas do vaso de latão até que dois a três milímetros de etano sólido sejam visíveis.
O etano está agora a uma temperatura ideal para congelar amostras biológicas. Conecte o Dewar mergulhando cuidadosamente à base do êmbolo manual. Aperte um par de pinças de fixação envolvendo com segurança a fita ao redor do braço mergulhando e a base da pinça.
Segure o braço mergulhando e baixe lentamente a pinça no etano líquido, deprimindo o pedal do pé. Ajuste a localização do Dewar mergulhando para que as pinças se localizem no meio do etano líquido, evitando contato com o anel de etano sólido. Prepare materiais e acessórios de mergulho.
Prepare o papel de mancha cortando cada papel filtro circular em tiras de aproximadamente um centímetro de largura. Evite tocar no centro do papel manchador e descarte as peças finais menores. É importante garantir que as tiras de papel manchado estejam secas, limpas e livres de contaminantes.
Antes de mergulhar, coloque as caixas de grade no Dewar mergulhando nas ranhuras adequadas. Certifique-se de que a grade cobre nossa livre para girar. Prepare espécimes crioEM por mergulhar congelando.
Devido à diversidade de preparações de grade e grade, siga protocolos recomendados para a tornando as redes hidrofílicas. Para manusear corretamente as grades, use pinças limpas e secas para pegar as redes hidrofílicas no anel externo. Deslize o grampo de plástico para fixar a grade e bata suavemente na pinça para garantir que a grade esteja bem fixada.
Aplique três microliters de amostra na frente da grade mantida na pinça de fixação. Coloque firmemente a pinça no braço manual, enrolando a fita ao redor da base da pinça. A amostra está pronta para ser borrada e mergulhada.
Segure cada extremidade de uma tira limpa de papel manchador entre os dedos indicadores e os polegares. Coloque as mãos na borda do Dewar mergulhando para estabelecer uma posição estável. O papel de mancha deve estar a aproximadamente um centímetro da superfície da rede.
Dobre o papel de mancha até que o centro entre em contato com a grade. É importante que o papel de mancha seja paralelo à superfície da rede para permitir o contato e evitar danos na rede. Quando a frente líquida móvel parar de se espalhar, comece a contar.
Limpe a grade por cinco segundos. Estalar os dedos, esticando o papel manchador e removendo-o rapidamente da superfície da rede. Simultaneamente, pressione o pedal do pé para soltar o braço de mergulho manual, mergulhando a pinça segurando a grade no etano líquido.
Mantendo a grade recém congelada no etano líquido, retire cuidadosamente as pinças do braço de mergulho manual. Despretou cuidadosamente as pinças para que a grade seja removível. Mova a rede para o reservatório de nitrogênio líquido abaixo do vaso de etano de latão com um movimento rápido do etano para o nitrogênio líquido.
Coloque a grade na caixa da grade. Resultados representativos. A partir deste vídeo, os pesquisadores devem ser capazes de preparar grades CryoEM, como esta, com muitos quadrados contendo filmes finos de gelo vítreo para imagens de alta resolução.
A concentração da amostra e o tempo de mancha podem ser ajustados para otimizar a densidade de partículas. Aqui, demonstraremos o fluxo de trabalho completo para congelar amostras de CryoEM usando o método de mancha e mergulho. Use uma pinça de fixação limpa para pegar uma grade fresca e fixar a grade no lugar.
Aplique três microliters de amostra no lado hidrofílico da rede e proteja pinças no braço de mergulho manual, envolvendo a fita ao redor da alça da pinça. Posicione o papel de mancha paralela à superfície da grade e dobre suavemente o papel de mancha em direção à grade para iniciar a mancha. Após o tempo desejado, mova o papel manchador em um movimento de estalo para longe da superfície da grade enquanto deprimi o pedal do pé para soltar o braço mergulhando, mergulhando a grade no etano líquido.
Descontrate cuidadosamente a fita ao redor da pinça e o braço de mergulho manual. Com um movimento rápido, transfira rapidamente a rede do navio de etano para o reservatório de nitrogênio líquido. Coloque a grade na caixa de armazenamento da grade e enrole as pinças em um Kim Wipe para secar;repita.
