Burada açıklanan manuel dalma yöntemi, numuneleri iletim elektron mikroskopisi için hazırlamak için uygun maliyetli, güvenilir bir yöntemdir. Bu videoda, manuel pistonun nasıl kurulacağını, kriyojenin nasıl hazırlanacağını ve EM ızgaralarının manuel olarak nasıl şişirilmiş ve dalma yapılacağını göstereceğiz. Manuel Dalma Ortamını hazırlayın.
Bu prosedür, %95'ten büyük nem oranına sahip 40 santigrat derecede tutulan soğuk bir odada yapılmalıdır Burada gösterilen ve manuel şişkinlik ve dalma için çevrimiçi protokolde açıklandığı gibi malzemeleri kullanmanızı öneririz. Kriyojen Dewar ve Manuel Pistonu hazırlayın. Kriyojen Dewar'ı monte etmek için, önce platform tabanını mavi strafor Dewar'ın altına monte edin ve düz ve düz olmasını sağlayın.
Daha sonra etan kap tutucuyu platform tabanının üzerine yerleştirin ve pirinç etan kabını yerleştirin. Son olarak, dönen ızgara depolama platformunu oturtun. Ardından, dalgıç Dewar'ı manuel pistonun tabanına bulun.
Etan kabını dalma kolunun altına ortalayın ve dalgıç Dewar'ı üsse sabitleyin. Manuel dalma yüksekliğini ayarlamak için, önce dalma kolunun tabanına taze bant takın. Ardından, bandı dalma koluna ve cımbız tabanına güvenli bir şekilde sararak bir çift sıkma cımbızı bağlayın.
Cımbızın hafifçe dokunarak sıkıca takıldığından emin olun. Dalma kolunu tutun ve ayak pedalını bastırarak cımbızı yavaşça pirinç etan kabına 2007'den fazla haline haline alın. Dalma Dewar'ın konumunu, cımbızın pirinç etan kabının ortasına yermesi için ayarlayın.
Cımbız uçları, cımbızın ve manuel pistonun zarar görmesini önlemek için pirinç etan kabının boyutuna veya altına temas etmemelidir. Konum ayarlandıktan sonra manuel dalma kolunu sıfırlayın. Cryogen'i hazırlayın.
Kriyojen hazırlığı iyi havalandırılmış bir odada yapılmalı ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir. Başlamak için, zayıf sıvı nitrojen doğrudan dalma Dewar içine, sıvı nitrojen seviyesi pirinç etan kabının tepesine ulaştığında durur. Sistem, sıvı nitrojen şiddetli bir şekilde köpürmeyi durdurduktan sonra devam edecek kadar soğuk olmalıdır.
Bu yaklaşık beş dakika sürecektir. Etan sıkıştırılmış gaz olarak gelir ve yoğunlaştırılması gerekir. Optimum etan yoğunlaşma için gaz akışını ayarlamak için, etan gazı hattının ucunu 250 millik bir su kabına yerleştirin ve köpürmeyi gözlemleyin.
Gaz akışı, su yüzeyini şiddetli bir şekilde bozmayan sabit bir kabarcık akışı üretmelidir. Etan yoğuşmaya başlamak için, etan gazı hattının ucunu pirinç etan kabının altına yerleştirin. Metal ucu yavaşça karıştırın ve etanları sıvılaştırmaya başlayın.
Etan soğumaya başlar başlamaz, duyulabilir bir ses çıkarır. Pirinç etan kabını sıvı etan dolu dörtte üçüne doldurun. Dalgıç Dewar'ı sıvı nitrojenle kaplayın, pirinç etan kabına dokunmasını ancak içine dökülmemesini sağlayın.
Sıvı nitrojenin eklenmesi, tek tip etan dondurma için gereklidir. Köpük kapağı mavi dalgıç Dewar üzerine yerleştirin ve etan tamamen katılaşmak için izin verin. Etan gazı akışını yeniden başlatın ve gaz hattının ucunu dikkatlice katı etan içine yerleştirin.
Ucun kabın içine dikey olarak yerleştirilmesi ve tabana etan dağıtılması önemlidir. Etanları eritmek ve sıvı etan seviyesini kabın tepesine çıkarmak için metal ucu yavaşça karıştırın. Kapağı yaklaşık bir dakika kapatın ve etan, iki ila üç milimetre katı etan görünene kadar pirinç kabın kenarlarının etrafında katılaşmaya izin verin.
Etan şimdi biyolojik numuneleri dondurmak için ideal bir sıcaklıkta. Dalma Dewar'ı manuel pistonun tabanına dikkatlice takın. Bandı dalma koluna ve cımbız tabanına güvenli bir şekilde sararak bir çift sıkma cımbızı sabitleyin.
Dalma kolunu tutun ve ayak pedalını bastırarak cımbızı yavaşça sıvı etan içine dirayaklayın. Dalma Dewar'ın konumunu, cımbızın sıvı etan ortasına yer edinecek şekilde ayarlayın ve katı etan halkasıyla temastan kaçının. Dalgıç Malzemeleri ve Aksesuarları hazırlayın.
Her dairesel filtre kağıdını yaklaşık bir santimetre genişliğinde şeritler halinde keserek şişkin kağıdı hazırlayın. Şişkin kağıdın ortasına dokunmaktan kaçının ve daha küçük uç parçalarını atın. Şişkin kağıt şeritlerinin kuru, temiz ve kirletici içermemesini sağlamak önemlidir.
Dalmadan önce, ızgara kutularını dalma Dewar'a uygun yuvalara yerleştirin. Izgaranın döndürme özgürlüğümüzü kapsadığından emin olun. Dondurucuya Dalarak CryoEM Örneklerini Hazırlayın.
Şebeke ve ızgara preparatlarının çeşitliliği nedeniyle, şebekelerin hidrofilik hale getirilmesi için önerilen protokolleri izleyin. Izgaraları düzgün bir şekilde işlemek için, dış halkadaki hidrofilik ızgaraları almak için temiz, kuru sıkma cımbızları kullanın. Izgaranın sabitlenebilmesi için plastik kelepçeyi kaydırın ve ızgaranın düzgün bir şekilde kenetlendiğini sağlamak için cımbızlara hafifçe dokunun.
Sıkma cımbızında tutulan ızgaranın önüne üç mikrolitre numune uygulayın. Bandı cımbız tabanının etrafına sararak cımbızları manuel dalma koluna sıkıca takın. Örnek artık şişirilmeye ve dondurulmaya hazır.
Temiz bir şişkinlik kağıdı şeridinin her ucunu işaret parmaklarınız ve başparmaklarınız arasında tutun. İstikrarlı bir pozisyon oluşturmak için ellerinizi dalgıç Dewar'ın kenarına koyun. Şişkinlik kağıdı ızgaranın yüzeyinden yaklaşık bir santimetre olmalıdır.
Ortadaki ızgarayla temas edene kadar şişkinlik kağıdını bükün. Şişkinlik kağıdının ızgara yüzeyine paralel olması, eşit temasa izin vermek ve ızgara hasarını önlemek için önemlidir. Mobil sıvı ön yayılmayı durdurduğunda saymaya başlayın.
Izgarayı beş saniyeliğine lekele. Parmaklarınızı birbirinden ayırın, şişkin kağıdı gerin ve ızgaranın yüzeyinden hızla çıkarın. Aynı anda, manuel dalma kolunu serbest bırakmak için ayak pedalına basın, ızgarayı tutan cımbızı sıvı etan içine daldırın.
Taze donmuş ızgarayı sıvı etan içinde tutarak, cımbızları manuel dalma kolundan dikkatlice ayırın. Cımbızı dikkatlice çıkarın, böylece ızgara çıkarılabilir. Izgarayı pirinç etan kabının altındaki sıvı azot rezervuarına, etandan sıvı nitrojene hızlı bir hareketle hareket ettirin.
Izgarayı kılavuz kutusuna yerleştirin. Temsili Sonuçlar. Bu videodan araştırmacılar, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ince vitreus buz filmleri içeren birçok kare ile bunun gibi CryoEM ızgaralarını hazırlayabilmelidir.
Numune konsantrasyonu ve şişkinlik süresi parçacık yoğunluğunu optimize etmek için ayarlanabilir. Burada, blot ve plunge yöntemini kullanarak CryoEM örneklerini dondurmak için tam iş akışını göstereceğiz. Taze bir ızgara almak ve ızgarayı yerinde sabitlemek için temiz bir sıkma cımbızı kullanın.
Izgaranın hidrofilik tarafına üç mikrolitre numune uygulayın ve bandı cımbız sapının etrafına sararak manuel dalma koluna cımbız sabitleyin. Şişkinlik kağıdını ızgara yüzeyine paralel yerleştirin ve şişkinliği başlatmak için şişkin kağıdı ızgaraya doğru hafifçe bükün. İstenilen sürenin ardından, lekeleme kağıdını ızgara yüzeyinden bir çıtlatma hareketiyle hareket ettirirken, ayak pedalını bastırarak dalma kolunu serbest bırakın, ızgarayı sıvı etan içine daldırın.
Bandı cımbızın ve manuel dalma kolunun etrafından dikkatlice gevşetin. Hızlı bir hareketle, ızgarayı etan kaptan sıvı nitrojen rezervuarına hızlı bir şekilde aktarın. Izgarayı ızgara depolama kutusuna yerleştirin ve cımbızı kuruması için kim silmeye sarın;tekrarlayın.
