שיטת הצלילה הידנית המתוארת כאן היא שיטה חסכונית ואמינה להכנת דגימות למיקרוסקופיית אלקטרונים שידור. בסרטון זה, אנו להדגים כיצד להגדיר את הבוכנה הידנית, להכין קריוגן, ולבצע סופג ידני וצלילה של רשתות EM. הכן את סביבת הצלילה הידנית.
הליך זה צריך להתבצע בחדר קר המתוחזק ב 40 מעלות צלזיוס עם לחות של יותר מ 95%אנו ממליצים להשתמש בחומרים המוצגים כאן וכפי שתואר בפרוטוקול המקוון עבור סופג ידני וצלילה. הכן את הקריוגן דיואר ואת הבוכנה הידנית. כדי להרכיב את קריוגן דיואר, ראשית להתקין את בסיס הפלטפורמה בתחתית הקלקר הכחול דיואר, להבטיח כי הוא שטוח ורמה.
לאחר מכן מניחים את מחזיק כלי האתאן על גבי בסיס הרציף ומכניסים את כלי האתאן מפליז. לבסוף, למקם את פלטפורמת אחסון רשת ספינינג. לאחר מכן, אתר את דיואר צולל לבסיס הבוכנה הידנית.
מרכז את ספינת האתאן מתחת לזרוע הצוללת ואבטח את דיואר צולל לבסיס. כדי להגדיר את גובה הצלילה הידני, תחילה חבר סרט טרי לבסיס הזרוע הצוללת. לאחר מכן, הדק זוג פינצטה מהדקת על ידי גלישה מאובטחת של הקלטת סביב הזרוע הצוללת ובסיס הפינצטה.
ודא פינצטה מחוברים בחוזקה על ידי הקשה עליהם בקלילות. החזק את זרוע הצלילה והורד לאט לאט את הפינצטה לתוך כלי האתאן מפליז על ידי דיכוי דוושת הרגל. התאם את המיקום של דיואר הצולל כך פינצטה לאתר לאמצע כלי האתאן פליז.
קצות פינצטה לא צריך ליצור קשר עם הגודל או התחתון של כלי האתאן פליז כדי למנוע נזק פינצטה בוכנה ידנית. לאחר המיקום מוגדר, לאפס את זרוע הצלילה הידנית. הכן את הקריוגן.
הכנת קריוגן צריכה להתבצע בחדר מאוורר היטב וציוד מגן אישי מתאים צריך להיות משוחק בכל עת. בתור התחלה, חנקן נוזלי עני ישירות לתוך Dewar צולל, עצירה כאשר רמת החנקן הנוזלי מגיע לחלק העליון של כלי האתאן פליז. המערכת צריכה להיות קרה מספיק כדי להמשיך לאחר החנקן הנוזלי מפסיק לבעבע באלימות.
זה ייקח בערך חמש דקות. אתאן מגיע כגז דחוס וצריך לדחוס אותו. כדי להגדיר את זרימת הגז עבור עיבוי אתאן אופטימלי, להכניס את קצה קו הגז אתאן לתוך מים 250 מל ולצפות המבעבע.
זרימת הגז צריכה לייצר זרם קבוע של בועות שאינו משבש באלימות את פני המים. כדי להתחיל לדחוס אתאן, מניחים את קצה קו הגז אתאן בתחתית כלי האתאן מפליז. מערבבים לאט את קצה המתכת ומתחילים להניך את האתאן.
ברגע שהאתאן יתחיל להתקרר, זה יעשה רעש נשמע. מלא את כלי האתאן מפליז לשלושה רבעים מלאים באתאן נוזלי. תמלא את דיואר הצוללת בחנקן נוזלי, מה שמבטיח שהוא ייגע בכלי האתאן מפליז אך לא יישפך לתוכו.
תוספת של חנקן נוזלי הכרחית להקפאת אתאן אחידה. מניחים את מכסה הקצף על דיואר הצולל הכחול, ומאפשרים לאתאן להתמצק לחלוטין. הפעל מחדש את זרימת גז האתאן והכניס בזהירות את קצה קו הגז לאתאן המוצק.
חשוב למקם את הקצה אנכית לתוך הכלי ולחלק אתאן בתחתית. מערבבים לאט את קצה המתכת כדי להמיס את האתאן ולהביא את רמת האתאן הנוזלי עד לחלק העליון של הכלי. סוגרים את המכסה כדקה ומאפשרים לאתאן להתגבש סביב קצוות כלי הפליז עד שניים עד שלושה מילימטרים של אתאן מוצק נראים.
האתאן נמצא כעת בטמפרטורה אידיאלית להקפאת דגימות ביולוגיות. חבר את דיואר צולל בזהירות לבסיס הבוכנה הידנית. הדקו זוג פינצטה מהדקת על ידי עטיפת הסרט סביב הזרוע הצונחת ובסיס הפינצטה.
החזק את זרוע הצלילה ולהוריד לאט את פינצטה לתוך האתאן הנוזלי על ידי מדכא את דוושת כף הרגל. התאם את המיקום של Dewar צולל כך פינצטה לאתר לאמצע האתאן הנוזלי, הימנעות ממגע עם טבעת האתאן מוצק. הכן חומרים ואביזרים צוללים.
הכן את נייר הכתמים על ידי חיתוך כל נייר סינון עגול לרצועות ברוחב של סנטימטר אחד. הימנעו מלגעת במרכז נייר הכתמים והשליכו את חתיכות הקצה הקטנות יותר. חשוב לוודא כי רצועות הנייר הכתומים יבשות, נקיות וללא מזהמים.
לפני הצלילה, מניחים את תיבות הרשת לתוך דיואר צולל לתוך החריצים הנכונים. ודא שהרשת מכסה את היכולת שלנו להסתובב. הכן דגימות CryoEM על ידי הקפאת צלילה.
בשל המגוון של רשתות ותכשירי רשת, בצע פרוטוקולים מומלצים לעיבוד הרשתות הידרופיליות. כדי לטפל כראוי ברשתות, השתמש פינצטה נקיה ויבשה כדי להרים את הרשתות ההידרופיליות בטבעת החיצונית. החלק את מלחצי הפלסטיק כדי לאבטח את הרשת והקש בעדינות על פינצטה כדי להבטיח שהרשת מהודקת כראוי.
החל שלושה microliters של מדגם על החלק הקדמי של הרשת מוחזק פינצטה מהדק. חברו את הפינצטה בחוזקה לזרוע הצלילה הידנית על ידי עטיפת הקלטת סביב בסיס הפינצטה. המדגם מוכן כעת להימחק ולצלל קפוא.
החזק כל קצה של רצועה נקייה של נייר סופג בין האצבעות והאגודלים. הנח את ידיך על קצה דיואר צולל כדי לבסס עמדה יציבה. נייר הכתמים צריך להיות בערך סנטימטר אחד מפני השטח של הרשת.
כופפו את נייר הכתמים עד שהמרכז יצור קשר עם הרשת. חשוב כי נייר סופג מקביל משטח הרשת כדי לאפשר מגע אפילו ולמנוע נזק לרשת. כאשר חזית הנוזל הנייד מפסיקה להתפשט, התחל לספור.
כתם הרשת במשך חמש שניות. הצמידו את אצבעותיכם לגזרים, מתחו את הנייר המנופח והסירו אותו במהירות מפני השטח של הרשת. בו זמנית, לחץ על דוושת הרגל כדי לשחרר את זרוע הצלילה הידנית, צולל את הפינצטה מחזיקה את הרשת לתוך האתאן הנוזלי.
תוך שמירה על הרשת הקפואה הטרייה באתאן הנוזלי, ניתקו בזהירות את פינצטה מזרוע הצלילה הידנית. בזהירות לבטל את פינצטה כך הרשת נשלפת. העבר את הרשת לתוך מאגר החנקן הנוזלי מתחת לכלי האתאן מפליז בתנועה מהירה אחת מהאיתאן לחנגן הנוזלי.
מקם את הרשת בתיבת הרשת. תוצאות מייצגות. מתוך וידאו זה, חוקרים צריכים להיות מסוגלים להכין רשתות CryoEM, כגון זה, עם ריבועים רבים המכילים סרטים דקים של קרח הזגום להדמיה ברזולוציה גבוהה.
ניתן להתאים את ריכוז הדגימה ואת זמן ההחלקה כדי למטב את צפיפות החלקיקים. כאן, אנו להדגים את זרימת העבודה המלאה להקפאת דגימות CryoEM באמצעות שיטת blot וצלילה. השתמש פינצטה מהדק נקי כדי להרים רשת חדשה ולאבטח את הרשת במקום.
החל שלושה microliters של מדגם בצד ההידרופילי של הרשת ופינצטה מאובטחת לזרוע הצלילה הידנית על ידי גלישת הקלטת סביב ידית פינצטה. מקם את נייר הכתמים במקביל למשטח הרשת וכופף בעדינות את נייר הכתמים לכיוון הרשת כדי ליזום כתמים. לאחר פרק הזמן הרצוי, הזז את נייר הכתם בתנועת הצמדה הרחק מפני הרשת תוך כדי דיכוי דוושת כף הרגל כדי לשחרר את הזרוע הצוללת, צולל את הרשת לתוך האתאן הנוזלי.
בזהירות לשחרר את הקלטת מסביב פינצטה וזרוע הצלילה הידנית. בתנועה מהירה אחת, העבירו במהירות את הרשת מכלי האתאן למאגר החנקן הנוזלי. מקם את הרשת בתיבת האחסון של הרשת ועטוף את פינצטה ב-Kim Wipe כדי להתייבש;חזור.
