El inicio de la apoptosis está mediado por la activación de caspasas en plataformas moleculares marcadoras. Presentamos la detección de la clave de iniciación del complejo de muerte celular DISC, que sirve como plataforma para la activación de la caspasa-8. La ventaja de esta técnica es que permite la detección del ensamblaje y la composición del complejo DISC junto con proporcionar información sobre el procesamiento de la caspasa-8 en este complejo.
Comience el experimento con células que son 80% a 90% confluentes y adherentes al plato. Deseche el medio y agregue medio fresco a las células adherentes. Luego estimule las células con la concentración seleccionada de CD95L manteniendo la placa en ángulo y canalizando el ligando en el medio sin tocar las células adherentes.
Para cosechar las células, coloque el plato celular sobre hielo. Agregue 10 mililitros de PBS frío a la suspensión celular y raspe las celdas conectadas de la placa. Recoja la suspensión celular en un tubo de 50 mililitros.
Lave el plato celular con 10 mililitros de PBS frío dos veces y agregue la solución de lavado en el mismo tubo de 50 mililitros. Luego centrifugue la suspensión celular a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo celular en un mililitro de PBS frío.
Luego transfiera la suspensión celular a un tubo de 1.5 mililitros. Centrifugar la suspensión celular y volver a suspender la bolita celular en un mililitro de PBS frío nuevamente. Repita la centrifugación una vez más, luego vuelva a suspender la bolita celular en un mililitro de tampón de lisis e incube durante 30 minutos en hielo.
Después de la incubación, centrifugue el lisado a la velocidad máxima durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, luego transfiera el sobrenadante a un tubo limpio. Deseche el pellet y recoja una muestra de 50 microlitros del lisado en otro tubo para determinar la concentración de proteína. Para la inmunoprecipitación, agregue dos microlitros de anticuerpo anti-APO1 y 10 microlitros de perlas de sefarosa de proteína A preparadas al lisado.
Agregue 10 microlitros de las cuentas solos a un tubo separado que contenga el lisado para que sirva como control de cuentas. Incubar la mezcla que contiene el lisado, los anticuerpos y las perlas de proteína A Sepharose durante la noche a cuatro grados centígrados con una mezcla suave. Al día siguiente, centrifugar la mezcla a 500 veces G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados.
Después de desechar el sobrenadante, lave las perlas agregando un mililitro de PBS frío y desechando el sobrenadante después de la centrifugación. Repita este paso al menos tres veces. Después de desechar el último lavado de PBS, aspire las perlas preferiblemente con una jeringa Hamilton de 50 microlitros.
Para realizar el Western blot, agregue 20 microlitros de tampón de carga 4X a las cuentas y caliente a 95 grados Celsius durante 10 minutos. Simultáneamente, calienta los controles de lisado a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Cargue los lisados, los inmunoprecipitantes y un estándar de proteína en un gel SDS al 12.5% y funcione con un voltaje constante de 80 voltios.
Después de completar la ejecución del gel, transfiera las proteínas del gel SDS a una membrana de nitrocelulosa. Después de que se complete la transferencia, coloque la membrana secada en una caja e incube durante una hora en solución de bloqueo bajo agitación suave, luego lave la membrana tres veces durante cinco minutos con PBST. Para detectar las proteínas, agregue el primer anticuerpo primario en la dilución indicada a la membrana e incube durante la noche a cuatro grados centígrados con una agitación suave.
Al día siguiente, lave la membrana con tres lavados PBST de cinco minutos, luego incube la membrana con 20 mililitros de anticuerpo secundario con agitación suave durante una hora a temperatura ambiente. Lave la membrana tres veces con PBST nuevamente. Después de desechar el último lavado de PBST, agregue aproximadamente un mililitro de sustrato de peroxidasa de rábano picante a la membrana y detecte la señal de quimioluminiscencia.
La estimulación de las células HeLa-CD95 del cáncer de cuello uterino con CD95L resultó en un alto nivel de formación de CD95 DISC monitoreada a través de la inmunoprecipitación CD95. Cd95, FADD, procaspasa-8, procaspasa-10 y c-FLIPS se observaron en estas inmunoprecipitaciones de CD95 que indican una formación eficiente de DISC. Los productos de escisión de p43-FLIP y p22-FLIP se detectaron en las inmunoprecipitaciones, indicando activación de la caspasa-8.
Las células HeLa-CD95 que sobreexpresan c-FLIP durante mucho tiempo se utilizaron para el análisis de la formación de CD95 DISC. Al igual que las células heLa-CD95 parentales, no se detectó reclutamiento de FADD, procaspasa-9, procaspasa-10, proteínas c-FLIP y PARP1 en las inmunoprecipitaciones de estas células sin tratamiento con CD95L. Las células T primarias activadas se caracterizaron por altos niveles de CD95, FADD, procaspasa-8, procaspasa-10 y c-FLIPS en inmunoprecipitaciones anti-CD95.
Esta técnica permite el análisis de la formación molecular de DISC, incluyendo el procesamiento de caspasa-8 en el DISC. Todos los pasos de lavado son muy importantes. Además, los puntos de estimulación y los tiempos de incubación deben tomarse en serio.
Esta es la única forma de medir el ensamblaje en el complejo DISC. Sin embargo, para medir la activación de la caspasa-8, también se pueden implementar ensayos de actividad de la caspasa-8. Este enfoque nos permitió obtener nuevos conocimientos sobre la iniciación de la apoptosis.
