A iniciação da apoptose é mediada pela ativação de caspases em plataformas moleculares marcadoras. Apresentamos a detecção do disc complexo de morte celular de iniciação chave, que serve como uma plataforma para ativação caspase-8. A vantagem dessa técnica é que permite a detecção do conjunto e a composição do complexo disc, juntamente com o fornecimento de informações sobre o processamento caspase-8 neste complexo.
Comece o experimento com células que são de 80% a 90% confluentes e aderentes ao prato. Descarte o meio e adicione meio fresco às células aderentes. Em seguida, estimule as células com a concentração selecionada de CD95L segurando a placa em um ângulo e encalhando o ligante para o meio sem tocar nas células aderentes.
Para colher as células, coloque o prato de célula no gelo. Adicione 10 mililitros de PBS frios à suspensão da célula e raspe as células anexadas da placa. Colete a suspensão celular em um tubo de 50 mililitros.
Lave o prato da célula com 10 mililitros de PBS frio duas vezes e adicione a solução de lavagem no mesmo tubo de 50 mililitros. Em seguida, centrifugar a suspensão celular a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o supernasce, resuspenque a pelota celular em um mililitro de PBS frio.
Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar a suspensão celular e resuspensar a pelota celular em um mililitro de PBS frio novamente. Repita a centrifugação mais uma vez, depois resuspense a pelota celular em um mililitro de tampão de lise e incuba-a por 30 minutos no gelo.
Após a incubação, centrifute o lysate em velocidade máxima por 15 minutos a quatro graus Celsius, em seguida, transfira o sobrenante para um tubo limpo. Descarte a pelota e colete uma amostra de 50 microliter do lysate em outro tubo para determinar a concentração proteica. Para imunoprecipitação, adicione dois microliters de anticorpo anti-APO1 e 10 microlitres de contas de proteína sepharose preparadas ao lise.
Adicione 10 microliters das contas sozinhos a um tubo separado contendo o lysate para servir como um controle de contas. Incubar a mistura contendo o liseto, os anticorpos e as contas de proteína sepharose durante a noite a quatro graus Celsius com mistura suave. No dia seguinte, centrifufique a mistura a 500 vezes G por quatro minutos a quatro graus Celsius.
Depois de descartar o supernasce, lave as contas adicionando um mililitro de PBS frio e descartando o supernatante após centrifugação. Repita este passo pelo menos três vezes. Depois de descartar a última lavagem PBS, aspire as contas de preferência com uma seringa Hamilton de 50 microliter.
Para executar a mancha ocidental, adicione 20 microliters de tampão de carregamento 4X às contas e aqueça a 95 graus Celsius por 10 minutos. Simultaneamente, aqueça os controles de lise a 95 graus Celsius durante cinco minutos. Carregue os lises, imunoprecipitantes e um padrão de proteína em um gel SDS de 12,5% e execute com uma tensão constante de 80 volts.
Após a execução do gel, transfira as proteínas do gel SDS para uma membrana nitrocelulose. Após a transferência estiver completa, coloque a membrana manchada em uma caixa e incuba-a por uma hora na solução de bloqueio sob agitação suave, depois lave a membrana três vezes por cinco minutos com PBST. Para detectar as proteínas, adicione o primeiro anticorpo primário na diluição indicada à membrana e incuba-o durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave.
No dia seguinte, lave a membrana com três lavagens PBST de cinco minutos, depois incuba a membrana com 20 mililitros de anticorpo secundário com agitação suave por uma hora à temperatura ambiente. Lave a membrana três vezes com PBST novamente. Depois de descartar a última lavagem PBST, adicione aproximadamente um mililitro de substrato de peroxidase de rabanete à membrana e detecte o sinal de quimioluminescência.
Estimulação do câncer cervical As células HeLa-CD95 com CD95L resultaram em um alto nível de formação de DISCO CD95 monitorado via imunoprecipitação CD95. CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 e c-FLIPS foram observados nessas imunoprecipitações CD95 indicando formação eficiente de DISCOs. Os produtos de decote de p43-FLIP e p22-FLIP foram detectados nas imunoprecipitações, indicando ativação do invólucro-8.
Células HeLa-CD95 que expressam por longo tempo c-FLIP foram utilizadas para análise da formação de DISCO CD95. Semelhante às células HeLa-CD95 parentais, não foi detectado o recrutamento de FADD, procaspase-9, procaspase-10, proteínas c-FLIP e PARP1 nas imunoprecipitações dessas células sem tratamento CD95L. As células T primárias ativadas foram caracterizadas por altos níveis de CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 e c-FLIPS em imunoprecipitações anti-CD95.
Esta técnica permite a análise da formação de DISC molecular, incluindo o processamento de caspase-8 no DISCO. Todas as etapas de lavagem são muito importantes. Além disso, os pontos de estimulação e os tempos de incubação devem ser levados a sério.
Esta é a única maneira de medir a montagem no complexo DISC. No entanto, para medir a ativação caspase-8, pode-se também implementar ensaios de atividade caspase-8. Essa abordagem nos permitiu obter novas percepções sobre a iniciação da apoptose.
