Die Apoptose-Initiation wird durch die Aktivierung von Caspasen an molekularen Markerplattformen vermittelt. Wir präsentieren den Nachweis des Schlüsselinitiationszelltodkomplexes DISC, der als Plattform für die Caspase-8-Aktivierung dient. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Erkennung der Baugruppe und der Zusammensetzung des DISC-Komplexes ermöglicht und Informationen über die Caspase-8-Verarbeitung in diesem Komplex liefert.
Beginnen Sie das Experiment mit Zellen, die zu 80% bis 90% konfluent sind und an der Schale haften. Verwerfen Sie das Medium und fügen Sie den adhärenten Zellen frisches Medium hinzu. Stimulieren Sie dann die Zellen mit der ausgewählten Konzentration von CD95L, indem Sie die Platte in einem Winkel halten und den Liganden in das Medium pipettieren, ohne die adhäsiven Zellen zu berühren.
Um die Zellen zu ernten, legen Sie die Zellschale auf Eis. Geben Sie 10 Milliliter kaltes PBS in die Zellsuspension und kratzen Sie die angeschlossenen Zellen von der Platte ab. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-Milliliter-Röhrchen.
Waschen Sie die Zellschale zweimal mit 10 Milliliter kaltem PBS und geben Sie die Waschlösung in dasselbe 50-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspen Sie das Zellpellet in einem Milliliter kaltem PBS.
Anschließend wird die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen gegeben. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und resuspenieren Sie das Zellpellet wieder in einem Milliliter kaltem PBS. Wiederholen Sie die Zentrifugation noch einmal, dann resuspen Sie das Zellpellet in einem Milliliter Lysepuffer und inkubieren Sie es für 30 Minuten auf Eis.
Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Lysat mit maximaler Geschwindigkeit für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und geben Sie den Überstand dann in ein sauberes Rohr. Entsorgen Sie das Pellet und sammeln Sie eine 50-Mikroliter-Probe des Lysats in einem anderen Röhrchen, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Zur Immunpräzipitation fügen Sie dem Lysat zwei Mikroliter Anti-APO1-Antikörper und 10 Mikroliter vorbereitete Protein A Sepharose-Perlen hinzu.
10 Mikroliter der Perlen allein in ein separates Röhrchen geben, das das Lysat enthält, um als Perlenkontrolle zu dienen. Die Mischung, die das Lysat, die Antikörper und die Protein A Sepharoseperlen enthält, über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanfter Vermischung inkubieren. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Mischung bei 500 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, waschen Sie die Perlen, indem Sie einen Milliliter kaltes PBS hinzufügen und den Überstand nach der Zentrifugation verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens dreimal. Nachdem Sie die letzte PBS-Wäsche entsorgt haben, saugen Sie die Perlen vorzugsweise mit einer 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze ab.
Um den Western Blot durchzuführen, fügen Sie 20 Mikroliter 4X Ladepuffer zu den Perlen hinzu und erhitzen Sie ihn 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Gleichzeitig erhitzen Sie die Lysatsteuerung bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Laden Sie die Lysate, Immunpräzipitiva und einen Proteinstandard auf ein 12,5% SDS-Gel und laufen Sie mit einer konstanten Spannung von 80 Volt.
Nachdem der Gellauf abgeschlossen ist, übertragen Sie die Proteine aus dem SDS-Gel auf eine Nitrocellulosemembran. Nachdem der Transfer abgeschlossen ist, legen Sie die abgefleckte Membran in eine Box und inkubieren Sie sie für eine Stunde in Blocklösung unter sanfter Bewegung, dann waschen Sie die Membran dreimal für fünf Minuten mit PBST. Um die Proteine nachzuweisen, geben Sie den ersten primären Antikörper in der angegebenen Verdünnung in die Membran und inkubieren Sie ihn über Nacht bei vier Grad Celsius unter sanfter Bewegung.
Am nächsten Tag waschen Sie die Membran mit drei Fünf-Minuten-PBST-Waschungen, dann inkubieren Sie die Membran mit 20 Millilitern Sekundärantikörper mit sanftem Schütteln für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST erneut. Nachdem Sie die letzte PBST-Wäsche verworfen haben, geben Sie etwa einen Milliliter Meerrettichperoxidase-Substrat in die Membran und erkennen Sie das Chemolumineszenzsignal.
Die Stimulation von Gebärmutterhalskrebs-HeLa-CD95-Zellen mit CD95L führte zu einer hohen CD95-DISC-Bildung, die über die CD95-Immunpräzipitation überwacht wurde. CD95, FADD, Procaspase-8, Procaspase-10 und c-FLIPS wurden in diesen CD95-Immunpräzipitationen beobachtet, was auf eine effiziente DISC-Bildung hinweist. Die Spaltprodukte von p43-FLIP und p22-FLIP wurden in den Immunpräzipitationen nachgewiesen, was auf eine Caspase-8-Aktivierung hinweist.
HeLa-CD95-Zellen, die c-FLIP long überexprimieren, wurden zur Analyse der CD95-DISC-Bildung verwendet. Ähnlich wie bei elterlichen HeLa-CD95-Zellen wurde in den Immunpräzipitationen dieser Zellen ohne CD95L-Behandlung keine Rekrutierung von FADD-, Procaspase-9-, Procaspase-10-, c-FLIP-Proteinen und PARP1 nachgewiesen. Aktivierte primäre T-Zellen waren durch hohe Konzentrationen von CD95, FADD, Procaspase-8, Procaspase-10 und c-FLIPS in Anti-CD95-Immunpräzipitationen gekennzeichnet.
Diese Technik ermöglicht die Analyse der molekularen DISC-Bildung, einschließlich der Verarbeitung von Caspase-8 an der DISC. Alle Waschschritte sind sehr wichtig. Zudem sollten Stimulationspunkte und Inkubationszeiten ernst genommen werden.
Nur so kann die Baugruppe auf dem DISC-Komplex vermessen werden. Um die Caspase-8-Aktivierung zu messen, kann man jedoch auch Caspase-8-Aktivitätsassays implementieren. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, neue Einblicke in die Apoptose-Initiation zu gewinnen.
