자멸 개시는 마커 분자 플랫폼에서 카스파스의 활성화에 의해 중재된다. 우리는 caspase-8 활성화를 위한 플랫폼 역할을 하는 키 개시 세포 죽음 복합 디스크의 검출을 제시합니다. 이 기술의 장점은 이 단지에서 caspase-8 처리에 대한 정보를 제공하는 것과 함께 DISC 컴플렉스의 어셈블리 및 조성물을 검출할 수 있다는 것입니다.
80%에서 90%의 컨런트및 접시를 준수하는 세포로 실험을 시작합니다. 배지를 버리고 부착 셀에 신선한 배지를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 비스듬히 잡고 응집세포를 건드리지 않고 배지로 리간드를 피펫팅하여 CD95L의 선택된 농도로 세포를 자극한다.
세포를 수확하려면 세포 접시를 얼음 위에 놓습니다. 셀 서스펜션에 차가운 PBS 10 밀리리터를 추가하고 부착된 세포를 플레이트에서 긁어냅니다. 50 밀리리터 튜브에서 세포 현탁액을 수집합니다.
차가운 PBS 10 밀리리터로 셀 접시를 두 번 씻고 동일한 50 밀리리터 튜브에 세척 용액을 추가하십시오. 그런 다음 섭씨 4도에서 5 분 동안 500 배 G에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상체를 폐기한 후, 차가운 PBS의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 놓습니다.
그런 다음 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 세포 현탁액을 원심분리하고 감기 PBS의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 원심분리를 다시 한 번 반복한 다음, 세포 펠릿을 용해 버퍼 1밀리리터로 다시 분리하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
인큐베이션 후, 섭씨 4도에서 최대 속도로 lysate을 원심분리한 다음 상체를 깨끗한 튜브로 옮킵니다. 펠릿을 버리고 단백질 농도를 결정하기 위해 다른 튜브에서 용액의 50 마이크로 리터 샘플을 수집합니다. 면역 침전을 위해, 용액에 항체 항체의 2개의 마이크로리터 및 준비된 단백질 A Sepharose 구슬의 10 마이크로리터를 용액에 추가합니다.
비즈 컨트롤역할을 하기 위해 비드의 마이크로리터 10개만 별도의 튜브에 첨가한다. lysate를 포함 하는 혼합물을 배양, 항체, 그리고 단백질 A Sepharose 부드러운 혼합과 섭씨 4 섭씨에서 하룻밤 구비. 다음 날, 원심 분리는 섭씨 4도에서 4 분 동안 500 배 G에서 혼합물을 분리합니다.
상체를 폐기한 후, 차가운 PBS 의 1 밀리리터를 추가하고 원심 분리 후 상퍼를 폐기하여 구슬을 씻으십시오. 이 단계를 적어도 세 번 반복합니다. 마지막 PBS 세척을 폐기 한 후, 바람직하게는 50 마이크로 리터 해밀턴 주사기와 구슬을 흡인.
서부 블롯을 수행하려면 구슬에 4X 로딩 버퍼 20 마이크로리터를 추가하고 10분 동안 섭씨 95도의 열을 가열합니다. 동시에 용액 컨트롤을 섭씨 95도에서 5분간 가열합니다. 12.5%SDS 젤에 lysates, 면역 침전제 및 단백질 표준을 적재하고 80볼트의 일정한 전압으로 실행합니다.
젤 실행이 완료되면 SDS 젤에서 니트로 셀룰로오스 막으로 단백질을 전달합니다. 전송이 완료되면, 상자에 블로티 드 멤브레인을 배치하고 부드러운 동요에서 블록 용액에 한 시간 동안 인큐베이션, 다음 PBST와 5 분 동안 멤브레인을 세 번 세척. 단백질을 검출하기 위하여는, 막에 표시된 희석에 첫번째 1 차적인 항체를 추가하고 온화한 동요와 섭씨 4도에서 밤새 인큐베이션합니다.
다음 날, 3 개의 5 분 PBST 세척으로 막을 씻은 다음 실온에서 1 시간 동안 부드러운 흔들림으로 20 밀리리터의 이차 항체로 멤브레인을 배양하십시오. 다시 PBST로 멤브레인을 세 번 씻으십시오. 마지막 PBST 세척을 폐기한 후, 고추냉이 과산화기기류의 약 1밀리리터를 멤브레인에 추가하고 화학 발광 신호를 감지합니다.
CD95L을 가진 자궁 경관암 HeLa-CD95 세포의 자극은 CD95 면역 침전을 통해 감시된 CD95 DISC 형성의 높은 수준을 초래했습니다. CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 및 c-FLIPS는 효율적인 디스크 형성을 나타내는 이러한 CD95 면역 침전물에서 관찰되었다. p43-FLIP 및 p22-FLIP의 골짜기 제품은 면역 침전물에서 검출되었으며, 이는 caspase-8 활성화를 나타낸다.
C-FLIP를 오랫동안 과도하게 발현하는 HeLa-CD95 세포는 CD95 DISC 형성의 분석을 위해 사용되었습니다. 부모 HeLa-CD95 세포와 유사하게, CD95L 처리 없이 이들 세포로부터 의 면역침전증에서 FADD, procaspase-9, procaspase-10, c-FLIP 단백질 및 PARP1의 모집이 검출되지 않았다. 활성화된 1차 T세포는 CD95 면역침전에서 높은 수준의 CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 및 c-FLIPS를 특징으로 하였다.
이 기술은 DISC에서 caspase-8의 처리를 포함하여 분자 디스크 형성의 분석을 허용합니다. 모든 세탁 단계는 매우 중요합니다. 또한 자극 지점과 인큐베이션 시간을 심각하게 고려해야 합니다.
이것은 DISC 컴플렉스에서 어셈블리를 측정하는 유일한 방법입니다. 그러나 caspase-8 활성화를 측정하기 위해 caspase-8 활동 에세이도 구현할 수 있습니다. 이 접근 방식을 통해 우리는 자멸 개시에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있었습니다.
