Este protocolo genera un nuevo modelo para la epilepsia del lóbulo temporal en el que los ratones desarrollaron convulsiones espontáneas, y ha sido muy útil para investigar los mecanismos de la epileptogénesis y también para detectar nuevas terapias. Este procedimiento en ratones VGAT-Cre conduce de manera confiable a convulsiones electrográficas y motoras y motoras compuestas recurrentes espontáneas sin causar una muerte celular extensa del hipocampo que a menudo se observa después del estado epiléptico desencadenado con quimioconvulsivos o estimulación eléctrica continua. Para comenzar a fabricar auriculares, corte el alambre de acero inoxidable recubierto de politetrafluoroetileno de 3,5 centímetros de largo y quite aproximadamente un milímetro de la capa de aislamiento de ambos extremos del cable.
Coloque dos pasadores en un soporte de vicio, con la parte inferior del pasador con una hendidura más larga hacia abajo. Luego, aplique fundente en los extremos pelados del cable y la parte superior de los pines. Coloque la parte pelada del cable y la parte superior de los pasadores con la soldadura suficiente para recubrirla sin desbordarse en los lados.
Coloque uno de los extremos pelados del cable en el pasador lo más profundo posible mientras la soldadura se derrite. Repita el proceso para el segundo pin con el otro extremo pelado del cable. Después de enfriar los pines y soldar durante 10 segundos, retire los pines del soporte del vicio y luego tire de los pines para asegurarse de que la conexión entre el cable y los pines sea fuerte y se mantenga.
Enjuague los alfileres en agua fría seguido de secado. Más tarde, use un ohmímetro para verificar la conductancia entre el pin uno y el pin dos. Juntar los pines al final del cable para mantenerlos paralelos y cerrados.
Sujete un hemostático al centro del cable y gire el hemostático para girar el cable alrededor de sí mismo con fuerza. Después de quitar el hemostático, sujete las pinzas al alambre trenzado a dos milímetros por debajo de los pasadores para doblar el cable a 90 grados. Empuje el cable 90 grados hacia atrás sobre las pinzas, creando una curva más a un milímetro de la primera.
Use tijeras pequeñas y afiladas para cortar el alambre retorcido a 45 grados y 3.5 milímetros por debajo de la curva. Prepare dos electrodos trenzados bipolares o de doble clavija para cada auricular. Para preparar un electrodo de referencia, corte un cable con un alfiler soldado en ambos extremos en dos.
Luego, corte el cable a siete milímetros y doble el extremo del cable a un milímetro por debajo de la punta. Cubra la punta doblada de un milímetro del alambre con pinzas y gire el alambre apretado alrededor de las pinzas para crear un pequeño lazo con un milímetro de diámetro. Luego, doble el bucle perpendicular a la parte recta del cable para que la punta del cable apunte hacia afuera nuevamente.
Ensamble todos los electrodos en el pedestal de seis pines uno al lado del otro con una distancia de seis milímetros entre los dos electrodos bipolares. Coloque el electrodo de referencia en el orificio exterior central. Antes de proceder con la cirugía, registre el peso de los ratones VGAT-Cre de ocho semanas de edad.
Luego, coloque al animal en una cámara de inducción para inducir la anestesia. Coloque el ratón anestesiado en una almohadilla térmica a 37 grados centígrados. Si utiliza un sistema de temperatura controlada por retroalimentación, inserte la sonda de temperatura en el recto del animal para controlar la temperatura durante la cirugía.
Para comenzar la cirugía, redirija el flujo de anestesia inhalante al cono de la nariz y monte al animal en el marco estereotáxico colocando suavemente los dientes superiores frontales en la barra incisiva y mueva el cono hacia su nariz. Luego, coloque las barras para los oídos en las orejas y fíjelas en el marco estereotáxico. Asegúrese de que la cabeza del animal esté nivelada y centrada y no se pueda mover cuando se sondee ligeramente.
Una vez montado el animal, inyecte 0,5 mililitros de Normosol en los ratones para hidratarse y aplique lubricante ocular para evitar el secado corneal. Controle la profundidad de la anestesia pellizcando una pata de la extremidad posterior. Si el reflejo de retirada está ausente en el animal, proceda a eliminar el pelo del cuero cabelludo del ratón alrededor del área quirúrgica.
Cuando haya terminado, desinfecte el área limpia de la piel tres veces con una aplicación alterna de etanol y yodo, terminando con yodo, e inyecte 0.05 mililitros de bupivacaína al 0.25% por vía subcutánea. Haga una incisión en el cráneo con un bisturí y luego corte una parte de la piel con tijeras quirúrgicas, exponiendo el cráneo. Empuje la piel a un lado antes de limpiar el cráneo de todos los tejidos subyacentes con un hisopo de algodón.
Limpie el cráneo con peróxido de hidrógeno usando hisopos de algodón estériles y haga visibles las suturas del cráneo, el bregma y la lambda. Con el taladro montado estereotaxamente, mueva la punta de taladro a bregma en coordenadas cero X, Y y Z. Luego, levante y mueva el taladro a lambda para determinar sus coordenadas y determinar si el cabezal está nivelado.
Después de secar bien el cráneo, aplique una gota de adhesivo dental autograbado con el aplicador. Espere 60 segundos antes de curar el adhesivo dental con una luz UV dental durante 40 segundos. Una superficie brillante indica que el adhesivo ha sido efectivamente reticulado con el cráneo.
Con la ayuda de una broca de 0.031 pulgadas, perfore cuidadosamente dos orificios de rebabas bilateralmente en el cráneo a 5, 000 rotaciones por minuto, o RPM, evitando perforar el cerebro. Aplique gota de solución salina para mejorar la perforación de los orificios de rebaba. Para la implantación de electrodos de profundidad del hipocampo, perfore a tres milímetros posterior y tres milímetros laterales desde bregma.
Perfore un orificio de rebabas para el electrodo de referencia sobre el cerebelo detrás de la lambda a seis milímetros posteriores y cero milímetros laterales de bregma. A continuación, monte el pedestal de seis pines con electrodos ensamblados en el soporte del electrodo en el marco estereotáxico. Al alinear los electrodos por encima de los orificios de rebabas correspondientes, baje lentamente y navegue por los auriculares para ubicar las dos puntas de electrodos bipolares justo encima de los orificios de rebabas del hipocampo izquierdo y derecho, y si es necesario, ajuste el electrodo de referencia para flotar por encima del orificio sobre el cerebelo.
Cuando los electrodos de torsión del hipocampo estén justo encima de los agujeros, ponga a cero el eje Z y baje lentamente el electrodo a menos tres milímetros en el hipocampo derecho e izquierdo y guíe el electrodo de referencia hacia el orificio sobre el cerebelo. Preparó el cemento dental mezclando el polvo y el líquido en un tazón para mezclar. Luego, cubra la superficie del cráneo, los electrodos y el espacio entre la superficie del cráneo y la parte inferior del pedestal con cemento dental.
Una vez que el cemento se seque y se endurezca, separe el soporte del electrodo del brazo estereotáxico, levante el brazo y retire el soporte del pedestal. Después de administrar el ratón por vía subcutánea con ketoprofeno y Normosol, retire al animal del marco estereotáxico para mover al animal a la almohadilla térmica en la jaula del vivero. Una vez completamente despierto, devuelva al animal soltero a la jaula del vivero, alimente al animal con alimentos blandos y controle la pérdida de peso diariamente hasta 72 horas después de la cirugía.
En el diagrama de violín representativo, se muestra el número de estimulaciones requeridas por los ratones para el criterio de estado encendido. Los ratones típicamente alcanzaron el estado encendido o experimentaron cinco convulsiones motoras tónico-clónicas bilaterales después de 15 estimulaciones. Se encontró que la latencia a las convulsiones recurrentes espontáneas, o SRS, era de 10,7, y la frecuencia promedio de las convulsiones fue de 1,3 convulsiones por día.
La distribución confiable de SRS mostró que los ratones fueron epilépticos durante aproximadamente 23 días. En las imágenes representativas, se puede ver el número de neuronas anti-NeuN positivas o muertes neuronales en varios subcampos del hipocampo y la corteza entorrinal. Es importante que los dos electrodos bipolares entren suavemente en los dos orificios de rebaba, por lo que deben estar justo encima de los orificios de rebaba.
Y también, es importante aplicar cuidadosamente el cemento dental y dejar que se endurezca completamente antes de retirar el soporte del electrodo. Esta técnica nos permite generar ratones epilépticos y monitorearlos continuamente con grabación de EEG y también grabación de video, simultáneamente. Y con los experimentos que hacemos, podemos probar nuevas estrategias de tratamiento, como la terapia génica, para reducir la frecuencia, la duración y la gravedad de las convulsiones.
