פרוטוקול זה מייצר מודל חדש לאפילפסיה של האונה הרקתית שבה עכברים פיתחו התקפים ספונטניים, והוא היה שימושי מאוד לחקירת מנגנוני האפילפטוגנזה וגם לבדיקת טיפולים חדשניים. הליך זה בעכברי VGAT-Cre מוביל באופן אמין להתקפים אלקטרוגרפיים ומוטוריים מרוכבים ספונטניים חוזרים ונשנים מבלי לגרום למוות נרחב של תאי ההיפוקמפוס שנראה לעתים קרובות לאחר סטטוס אפילפטיקוס המופעל באמצעות כימו-פרכוסים או גירוי חשמלי מתמשך. כדי להתחיל לייצר אוזניות, חתכו חוט נירוסטה באורך 3.5 ס"מ מצופה פוליטטרה-פלואורואתילן והפשיטו כמילימטר אחד משכבת הבידוד משני קצות החוט.
שים שני פינים על מחזיק סגן, כאשר החלק התחתון של הסיכה יש חריץ ארוך יותר פונה כלפי מטה. לאחר מכן, יש למרוח שטף על הקצוות המופשטים של החוט ועל החלק העליון של הפינים. פח את החלק המופשט של החוט ואת החלק העליון של הפינים עם מספיק הלחמה כדי לצפות אותו מבלי לגלוש על הצדדים.
הניחו את אחד מקצוות החוט המופשטים לתוך הסיכה עמוק ככל האפשר בזמן שההלחמה נמסה. חזור על התהליך עבור הסיכה השנייה עם הקצה השני שהופשט של החוט. לאחר קירור הפינים והלחמה למשך 10 שניות, הסר את הפינים ממחזיק הפינים ולאחר מכן משוך אל הפינים כדי לוודא שהחיבור בין החוט לפינים חזק ומחזיק מעמד.
יש לשטוף את הפינים במים קרים ולאחר מכן לייבש. מאוחר יותר, השתמש באומטר כדי לאמת את המוליכות בין פין אחד לסיכה שתיים. חברו את הפינים בקצה החוט כדי להחזיק אותם במקביל ולהיסגר.
מהדקים את המוסטאט למרכז החוט ומסובבים את ההמוסטאט כדי לסובב את החוט סביב עצמו בחוזקה. לאחר הסרת ההמוסטט, הדקו את המלקחיים על החוט המעוות בשני מילימטרים מתחת לפינים כדי לכופף את החוט ב -90 מעלות. דוחפים את החוט 90 מעלות אחורה מעל המלקחיים, ויוצרים עוד כיפוף אחד במילימטר אחד מהראשון.
השתמש במספריים קטנים וחדים כדי לחתוך את החוט המעוות ב 45 מעלות ו -3.5 מילימטרים מתחת לכיפוף. הכן שתי אלקטרודות מעוותות דו-קוטביות או כפולות פינים עבור כל אוזנייה. כדי להכין אלקטרודת ייחוס אחת, חתכו חוט עם פין מולחם משני קצותיו לשניים.
לאחר מכן, חתכו את החוט בשבעה מילימטרים וכופפו את קצה החוט במילימטר אחד מתחת לקצה. כסו את קצה החוט המכופף במילימטר אחד במלקחיים וסובבו את החוט בחוזקה סביב המלקחיים ליצירת לולאה קטנה בקוטר מילימטר. לאחר מכן, כופפו את הלולאה בניצב לחלק הישר של החוט כדי לגרום לקצה החוט להצביע שוב כלפי חוץ.
הרכיבו את כל האלקטרודות למעמד של שישה פינים זה לצד זה עם מרחק של שישה מילימטרים בין שתי האלקטרודות הדו-קוטביות. מקם את אלקטרודת הייחוס בחור החיצוני האמצעי. לפני שתמשיך בניתוח, רשום את משקלם של עכברי VGAT-Cre בני שמונה שבועות.
לאחר מכן, הניחו את בעל החיים בתא זירוז כדי לגרום להרדמה. הניחו את העכבר המרדים על כרית חימום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אם אתם משתמשים במערכת טמפרטורה מבוקרת משוב, הכניסו את בדיקת הטמפרטורה לפי הטבעת של בעל החיים לצורך ניטור טמפרטורה במהלך הניתוח.
כדי להתחיל את הניתוח, יש לכוון מחדש את זרם ההרדמה האינהלנטי לקונוס האף ולהרכיב את בעל החיים במסגרת הסטריאוטקסית על ידי הכנסת השיניים העליונות הקדמיות בעדינות למוט החותכות והעברת החרוט אל אפו. לאחר מכן, הניחו את מוטות האוזניים לתוך האוזניים והצמידו למסגרת הסטריאוטקסית. ודאו שראשו של בעל החיים מפולס וממורכז ולא ניתן להזיז אותו כאשר בוחנים אותו מעט.
לאחר התקנת החיה, הזריקו 0.5 מיליליטר של נורמוסול על העכברים לצורך הידרציה ומרחו חומר סיכה עיני למניעת התייבשות הקרנית. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי צביטת כף גפה אחורית. אם רפלקס הנסיגה נעדר בחיה, המשך להסיר את שיער הקרקפת של העכבר סביב אזור הניתוח.
כאשר נעשה, לחטא את אזור העור נקי שלוש פעמים עם יישום לסירוגין של אתנול ויוד, גימור עם יוד, ולהזריק 0.05 מיליליטר של 0.25% bupivacaine תת עורית. בצע חתך על הגולגולת באמצעות אזמל ולאחר מכן לחתוך חלק של העור עם מספריים כירורגיים, לחשוף את הגולגולת. דחפו את העור הצידה לפני ניקוי הגולגולת מכל הרקמות שמתחתיה בעזרת צמר גפן.
נקו את הגולגולת במי חמצן באמצעות צמר גפן סטרילי והפכו את תפרי הגולגולת, הברגמה והלמבדה לגלויים. בעזרת המקדחה המותקנת באופן סטריאוטקסי, העבר את קצה המקדחה לברגמה בקואורדינטות אפס X, Y ו- Z. לאחר מכן, הרימו והזיזו את המקדחה ללמדא כדי לקבוע את הקואורדינטות שלה כדי לקבוע אם הראש ישר.
לאחר ייבוש יסודי של הגולגולת, יש למרוח טיפה אחת של דבק דנטלי לחריטה עצמית עם המוליך. המתן 60 שניות לפני ריפוי דבק השיניים עם אור UV דנטלי למשך 40 שניות. משטח מבריק מצביע על כך שהדבק הוצלב ביעילות עם הגולגולת.
בעזרת מקדח 0.031 אינץ ', בזהירות לקדוח שני חורי בור דו צדדי לתוך הגולגולת ב 5, 000 סיבובים לדקה, או סל"ד, הימנעות קידוח לתוך המוח. יש למרוח טיפת מלח כדי לשפר את קידוח חורי הבור. להשתלת אלקטרודות בעומק ההיפוקמפוס, יש לקדוח בשלושה מילימטרים אחוריים ושלושה מילימטרים רוחביים מברגמה.
קדח חור בור אחד עבור אלקטרודת הייחוס מעל המוח הקטן מאחורי הלמדא בשישה מילימטרים אחוריים ואפס מילימטרים רוחביים מברגמה. לאחר מכן, הרכיבו את הכן בן ששת הפינים עם אלקטרודות שהורכבו לתוך מחזיק האלקטרודות במסגרת הסטריאוטקסית. על ידי יישור האלקטרודות מעל חורי הבור המתאימים, הורידו לאט ונווטו את האוזנייה כדי לאתר את שני קצות האלקטרודות הדו-קוטביות ממש מעל חורי בור ההיפוקמפוס השמאלי והימני, ואם יש צורך, התאימו את אלקטרודת הייחוס כך שתרחף מעל החור מעל המוח הקטן.
כאשר אלקטרודות פיתול ההיפוקמפוס נמצאות ממש מעל החורים, אפסו את ציר Z והורידו לאט לאט את האלקטרודה למינוס שלושה מילימטרים לתוך ההיפוקמפוס הימני והשמאלי וכיוונו את אלקטרודת הייחוס לתוך החור שמעל המוח הקטן. הכינו את המלט הדנטלי על ידי ערבוב האבקה והנוזל בקערת ערבוב. לאחר מכן, כסו את משטח הגולגולת, את האלקטרודות ואת החלל שבין משטח הגולגולת לתחתית הכן במלט דנטלי.
לאחר שהמלט מתייבש ומתקשה, נתקו את מחזיק האלקטרודה מהזרוע הסטריאוטקסית, הרימו זרוע והוציאו את המחזיק מהכן. לאחר מתן העכבר תת עורית עם ketoprofen ו Normosol, להסיר את החיה מן המסגרת סטריאוטקסית להעביר את החיה על כרית מחוממת בכלוב vivarium. לאחר התעוררות מלאה, להחזיר את בעל החיים היחיד לכלוב vivarium, להאכיל את החיה עם מזון רך, ולפקח על הירידה במשקל מדי יום עד 72 שעות לאחר הניתוח.
בעלילת הכינור הייצוגית מוצג מספר הגירויים הנדרשים על ידי עכברים לקריטריון מצב ההדלקה. העכברים הגיעו בדרך כלל למצב של הדלקה או חוו חמישה התקפים מוטוריים טוניים-קלוניים דו-צדדיים לאחר 15 גירויים. ההשהיה להתקפים חוזרים ספונטניים, או SRS, נמצאה 10.7, והתדירות הממוצעת של ההתקפים הייתה 1.3 התקפים ליום.
התפלגות SRS אמינה הראתה כי העכברים היו אפילפטיים במשך כ -23 ימים. בתמונות המייצגות ניתן לראות את מספר תאי העצב החיוביים האנטי-NeuN או מקרי מוות עצביים בתת-שדות שונים של ההיפוקמפוס וקליפת המוח האנטורינלית. חשוב ששתי האלקטרודות הדו-קוטביות ייכנסו בצורה חלקה לשני חורי הבור, כך שהן צריכות להיות ממש מעל חורי הבור.
כמו כן, חשוב ליישם בזהירות את המלט הדנטלי ולתת לו להתקשות לחלוטין לפני הסרת מחזיק האלקטרודה. טכניקה זו מאפשרת לנו ליצור עכברים אפילפטיים ולנטר אותם ברציפות באמצעות הקלטת EEG וגם הקלטת וידאו, בו זמנית. ובעזרת הניסויים שאנו עושים, אנו יכולים לבחון אסטרטגיות טיפול חדשניות כגון ריפוי גנטי כדי להפחית את התדירות, משך הזמן והחומרה של ההתקפים.
