Этот протокол генерирует новую модель височной эпилепсии, при которой у мышей развивались спонтанные припадки, и это было очень полезно для исследования механизмов эпилептогенеза, а также для скрининга новых методов лечения. Эта процедура у мышей VGAT-Cre надежно приводит к спонтанным повторяющимся электрографическим и моторно-моторным композитным припадкам, не вызывая обширной гибели клеток гиппокампа, которая часто наблюдается после эпилептического статуса, вызванного химоконсулентами или непрерывной электрической стимуляцией. Чтобы начать делать гарнитуры, отрежьте проволоку из нержавеющей стали с покрытием из политетрафторэтилена длиной 3,5 сантиметра и снимите примерно один миллиметр изоляционного слоя с обоих концов провода.
Наденьте два штифта на держатель тисков так, чтобы нижняя часть штифта имела более длинную прорезь вниз. Затем нанесите флюс на зачищенные концы проволоки и верхушки штифтов. Зажверните зачищенную часть проволоки и верхнюю часть штифтов ровно столько, сколько нужно, чтобы покрыть ее, не переливаясь по бокам.
Поместите один из зачищенных концов проволоки в штифт как можно глубже, пока припой плавится. Повторите процесс для второго контакта с другим зачищенным концом провода. После охлаждения контактов и припоя в течение 10 секунд извлеките контакты из держателя тисков, а затем потяните за контакты, чтобы убедиться, что соединение между проводом и контактами прочное и держится.
Промойте штифты в холодной воде с последующей сушкой. Позже используйте омметр для проверки проводимости между первым и вторым контактами. Соедините штифты на конце провода вместе, чтобы держать их параллельно и закрывать.
Прижмите гемостат к центру проволоки и поверните гемостат, чтобы плотно обмотать проволоку вокруг себя. После снятия гемостата прижмите щипцы к скрученной проволоке на два миллиметра ниже штифтов, чтобы согнуть проволоку под углом 90 градусов. Надавите проволоку на 90 градусов назад на щипцы, создав еще один изгиб на один миллиметр от первого.
Используйте маленькие острые ножницы, чтобы разрезать скрученную проволоку под углом 45 градусов и на 3,5 миллиметра ниже изгиба. Подготовьте два биполярных или двухконтактных витых электрода для каждой гарнитуры. Чтобы подготовить один электрод сравнения, разрежьте провод с припаянным на обоих концах штырем на два.
Затем отрежьте проволоку на семь миллиметров и согните конец проволоки на один миллиметр ниже кончика. Накройте согнутый на один миллиметр кончик проволоки щипцами и плотно поверните проволоку вокруг щипцов, чтобы создать небольшую петлю диаметром один миллиметр. Затем согните петлю перпендикулярно прямой части проволоки, чтобы наконечник проволоки снова был направлен наружу.
Соберите все электроды в шестиконтактный пьедестал бок о бок с шестимиллиметровым расстоянием между двумя биполярными электродами. Поместите электрод сравнения в среднее наружное отверстие. Прежде чем приступить к операции, запишите вес восьминедельных мышей VGAT-Cre.
Затем поместите животное в индукционную камеру, чтобы вызвать анестезию. Поместите анестезированную мышь на грелку при температуре 37 градусов Цельсия. Если вы используете температурную систему с обратной связью, вставьте датчик температуры в прямую кишку животного для контроля температуры во время операции.
Чтобы начать операцию, перенаправьте поток ингаляционной анестезии на носовой конус и установите животное в стереотаксическую раму, аккуратно поместив передние верхние зубы в резец и переместив конус на нос. Затем вставьте амбушюры в уши и прикрепите их к стереотаксической раме. Убедитесь, что голова животного выровнена и отцентрирована и не может быть перемещена при легком зондировании.
После того, как животное сядет на лошадь, введите мышам 0,5 миллилитра нормосола для гидратации и нанесите глазную смазку, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Следите за глубиной анестезии, зажимая лапу задней конечности. Если рефлекс отмены отсутствует у животного, приступают к удалению волос на голове мыши вокруг хирургической области.
Когда закончите, трижды продезинфицируйте чистый участок кожи попеременным нанесением этанола и йода, заканчивая йодом, и введите 0,05 миллилитра 0,25% бупивакаина подкожно. Сделайте разрез на черепе с помощью скальпеля, а затем вырежьте часть кожи хирургическими ножницами, обнажив череп. Отодвиньте кожу в сторону перед очисткой черепа от всех подлежащих тканей ватным тампоном.
Очистите череп перекисью водорода с помощью стерильных ватных тампонов и сделайте видимыми швы черепа, брегму и лямбду. С помощью стереотаксически установленной дрели переместите сверлильный наконечник на брегму с нулевыми координатами X, Y и Z. Затем поднимите и переместите сверло в лямбду, чтобы определить его координаты, чтобы определить, ровна ли головка.
После тщательного высыхания черепа нанесите аппликатором одну каплю самотравящегося стоматологического клея. Подождите 60 секунд, прежде чем отверждать стоматологический клей стоматологическим ультрафиолетовым светом в течение 40 секунд. Глянцевая поверхность указывает на то, что клей был эффективно сшит с черепом.
С помощью 0,031-дюймового сверла осторожно просверлите два отверстия для заусенцев с обеих сторон в черепе со скоростью 5 000 оборотов в минуту или об / мин, избегая сверления в мозг. Нанесите каплю физиологического раствора, чтобы улучшить сверление отверстий для заусенцев. Для имплантации электродов глубиной гиппокампа просверлите три миллиметра сзади и три миллиметра сбоку от брегмы.
Просверлите одно отверстие для заусенца для электрода сравнения над мозжечком позади лямбды на расстоянии шести миллиметров сзади и нуля миллиметров сбоку от брегмы. Затем установите шестиконтактный постамент с собранными электродами в электрододержатель на стереотаксической раме. Совместив электроды над соответствующими отверстиями для заусенцев, медленно опустите и переместите гарнитуру, чтобы найти два наконечника биполярного электрода прямо поверх левого и правого отверстий для жернова гиппокампа, и, при необходимости, отрегулируйте электрод сравнения так, чтобы он завис над отверстием над мозжечком.
Когда электроды скручивания гиппокампа окажутся прямо над отверстиями, обнулите ось Z и медленно опустите электрод до минус трех миллиметров в правый и левый гиппокамп и направьте электрод сравнения в отверстие над мозжечком. Готовят стоматологический цемент, смешивая порошок и жидкость в миске. Затем покройте поверхность черепа, электроды и пространство между поверхностью черепа и дном пьедестала зубным цементом.
Как только цемент высохнет и затвердеет, отсоедините электрододержатель от стереотаксического рычага, поднимите рычаг и снимите держатель с пьедестала. После подкожного введения мышке кетопрофена и нормозола извлеките животное из стереотаксической рамки, чтобы переместить животное на подогреваемую подушку в клетке вивария. После полного пробуждения верните единственное животное в клетку вивария, накормите животное мягкой пищей и ежедневно следите за потерей веса в течение 72 часов после операции.
На репрезентативном скрипичном графике показано количество стимуляций, необходимых мышам для критерия зажженного состояния. Мыши обычно достигали разожженного состояния или испытывали пять двусторонних тонико-клонических моторных припадков после 15 стимуляций. Было обнаружено, что латентность спонтанных повторяющихся припадков, или SRS, составляет 10,7, а средняя частота приступов составляет 1,3 приступа в день.
Надежное распределение SRS показало, что мыши страдали эпилепсией в течение примерно 23 дней. На репрезентативных изображениях можно увидеть количество анти-NeuN-положительных нейронов или гибель нейронов в различных подполях гиппокампа и энторинальной коры. Важно, чтобы два биполярных электрода плавно входили в два отверстия для жернов, поэтому они должны находиться прямо над отверстиями для заусенцев.
Кроме того, важно аккуратно нанести стоматологический цемент и дать ему полностью затвердеть, прежде чем снимать держатель электрода. Этот метод позволяет нам генерировать мышей с эпилепсией и непрерывно контролировать их с помощью записи ЭЭГ, а также видеозаписи одновременно. И с помощью экспериментов, которые мы проводим, мы можем затем протестировать новые стратегии лечения, такие как генная терапия, чтобы уменьшить частоту, продолжительность и тяжесть приступов.
