Preparação e implantação de eletrodos para kindling elétrico de camundongos VGAT-CRE para gerar um modelo para epilepsia do lobo temporal

Este protocolo gera um novo modelo para epilepsia do lobo temporal em que camundongos desenvolveram crises espontâneas, e tem sido muito útil para investigar os mecanismos da epileptogênese e também para rastrear novas terapias. Este procedimento em camundongos VGAT-Cre leva de forma confiável a convulsões eletrográficas e motoras compostas espontâneas e motoras recorrentes sem causar morte celular extensa do hipocampo, que é frequentemente observada após status epilepticus desencadeado com quimioconvulsivantes ou estimulação elétrica contínua. Para começar a fazer fones de ouvido, corte o fio de aço inoxidável revestido de politetrafluoretileno de 3,5 centímetros de comprimento e retire cerca de um milímetro do revestimento de isolamento de ambas as extremidades do fio.

Coloque dois pinos em um suporte de vice, com a parte inferior do pino com uma fenda mais longa voltada para baixo. Em seguida, aplique fluxo nas extremidades descascadas do fio e nas partes superiores dos pinos. Estanhe a parte descascada do fio e a parte superior dos pinos com solda suficiente para revesti-lo sem transbordar para as laterais.

Coloque uma das extremidades descascadas do fio no pino o mais fundo possível enquanto a solda está derretendo. Repita o processo para o segundo pino com a outra extremidade descascada do fio. Depois de resfriar os pinos e a solda por 10 segundos, remova os pinos do suporte do vice e, em seguida, puxe para os pinos para garantir que a conexão entre o fio e os pinos seja forte e se mantenha.

Enxágue os pinos em água fria seguida de secagem. Posteriormente, use um ohmímetro para verificar a condutância entre o pino um e o pino dois. Junte os pinos na extremidade do fio para mantê-los paralelos e fechados.

Aperte um hemostático no centro do fio e gire o hemostático para torcer o fio em torno de si mesmo com força. Após a remoção do hemostático, prenda a pinça no fio torcido a dois milímetros abaixo dos pinos para dobrar o fio a 90 graus. Empurre o fio 90 graus para trás sobre a pinça, criando mais uma curvatura a um milímetro da primeira.

Use uma tesoura pequena e afiada para cortar o fio torcido a 45 graus e 3,5 milímetros abaixo da curva. Prepare dois eletrodos bipolares ou torcidos de pino duplo para cada fone de ouvido. Para preparar um eletrodo de referência, corte um fio com pino soldado em ambas as extremidades em dois.

Em seguida, corte o fio a sete milímetros e dobre a extremidade do fio a um milímetro abaixo da ponta. Cubra a ponta dobrada de um milímetro do fio com pinça e gire o fio firmemente ao redor da pinça para criar um pequeno laço com um milímetro de diâmetro. Em seguida, dobre o laço perpendicularmente à parte reta do fio para fazer com que a ponta do fio aponte para fora novamente.

Monte todos os eletrodos no pedestal de seis pinos lado a lado com uma distância de seis milímetros entre os dois eletrodos bipolares. Coloque o eletrodo de referência no orifício externo médio. Antes de prosseguir com a cirurgia, registre o peso dos camundongos VGAT-Cre de oito semanas de idade.

Em seguida, colocar o animal em uma câmara de indução para induzir a anestesia. Coloque o rato anestesiado numa almofada de aquecimento a 37 graus Celsius. Se estiver usando um sistema de temperatura controlado por feedback, insira a sonda de temperatura no reto do animal para monitoramento da temperatura durante a cirurgia.

Para iniciar a cirurgia, redirecione o fluxo de anestesia inalatória para o cone nasal e monte o animal na estrutura estereotáxica, colocando suavemente os dentes superiores anteriores na barra do incisivo e mova o cone para o nariz. Em seguida, coloque as barras auriculares nas orelhas e afixe na estrutura estereotáxica. Certifique-se de que a cabeça do animal esteja nivelada e centralizada e não possa ser movida quando ligeiramente sondada.

Uma vez montado o animal, injete 0,5 mililitros de Normosol nos ratos para hidratação e aplique lubrificante ocular para evitar o ressecamento da córnea. Monitore a profundidade da anestesia apertando uma pata do membro posterior. Se o reflexo de retirada estiver ausente no animal, proceda à remoção dos pelos do couro cabeludo do rato ao redor da área cirúrgica.

Quando feito, desinfetar a área limpa da pele três vezes com aplicação alternada de etanol e iodo, finalizando com iodo, e injetar 0,05 mililitros de bupivacaína a 0,25% por via subcutânea. Faça uma incisão no crânio usando um bisturi e, em seguida, corte uma parte da pele com tesoura cirúrgica, expondo o crânio. Empurre a pele para o lado antes de limpar o crânio de todos os tecidos subjacentes com um cotonete.

Limpe o crânio com peróxido de hidrogênio usando cotonetes estéreis e torne visíveis as suturas cranianas, bregma e lambda. Com a broca montada estereotaxicamente, mova a ponta da broca para o bregma nas coordenadas X, Y e Z zero. Em seguida, levante e mova a broca para lambda para determinar suas coordenadas para determinar se a cabeça está nivelada.

Depois de secar bem o crânio, aplique uma gota de adesivo dental autocondicionante com o aplicador. Aguarde 60 segundos antes de curar o adesivo dental com uma luz UV dental por 40 segundos. Uma superfície brilhante indica que o adesivo foi efetivamente reticulado com o crânio.

Com a ajuda de uma broca de 0,031 polegada, perfure cuidadosamente dois furos de rebarba bilateralmente no crânio a 5.000 rotações por minuto, ou RPM, evitando perfurar o cérebro. Aplicar gota de soro fisiológico para melhorar a perfuração dos furos de rebarba. Para implantação dos eletrodos de profundidade hipocampal, broca três milímetros posterior e três milímetros lateral do bregma.

Perfurar uma broca para o eletrodo de referência acima do cerebelo atrás do lambda a seis milímetros posteriores e zero milímetros laterais do bregma. Em seguida, monte o pedestal de seis pinos com eletrodos montados no suporte de eletrodos na estrutura estereotáxica. Ao alinhar os eletrodos acima dos orifícios de rebarba correspondentes, abaixe lentamente e navegue pelo fone de ouvido para localizar as duas pontas de eletrodos bipolares bem no topo dos orifícios da broca hipocampal esquerda e direita e, se necessário, ajuste o eletrodo de referência para pairar acima do orifício sobre o cerebelo.

Quando os eletrodos de torção do hipocampo estiverem logo acima dos orifícios, zere o eixo Z e abaixe lentamente o eletrodo para menos três milímetros no hipocampo direito e esquerdo e guie o eletrodo de referência para o orifício acima do cerebelo. Preparou o cimento dental misturando o pó e o líquido em uma tigela misturadora. Em seguida, cubra a superfície do crânio, os eletrodos e o espaço entre a superfície do crânio e o fundo do pedestal com cimento dental.

Uma vez que o cimento seque e endureca, desconecte o suporte do eletrodo do braço estereotáxico, levante o braço e remova o suporte do pedestal. Após administrar o camundongo por via subcutânea com cetoprofeno e Normosol, retirar o animal da estrutura estereotáxica para movê-lo para a almofada aquecida na gaiola do biotério. Uma vez totalmente acordado, devolva o único animal ao biotério, alimente-o com ração macia e monitore a perda de peso diariamente até 72 horas após a cirurgia.

Na parcela representativa do violino, o número de estímulos requeridos pelos camundongos para o critério de estado de ignição é mostrado. Os camundongos tipicamente atingiram o estado de kindled ou experimentam cinco convulsões motoras tônico-clônicas bilaterais após 15 estimulações. A latência para crises recorrentes espontâneas, ou SRS, foi de 10,7, e a frequência média das crises foi de 1,3 crises por dia.

A distribuição confiável do SRS mostrou que os camundongos foram epilépticos por aproximadamente 23 dias. Nas imagens representativas, o número de neurônios anti-NeuN positivos ou mortes neuronais em vários subcampos do hipocampo e córtex entorrinal pode ser visto. É importante que os dois eletrodos bipolares entrem suavemente nos dois orifícios da rebarba, então eles precisam estar bem acima dos orifícios da rebarba.

E também, é importante aplicar cuidadosamente o cimento dental e deixá-lo endurecer completamente antes de remover o suporte de eletrodos. Esta técnica nos permite gerar camundongos epilépticos e monitorá-los continuamente com gravação de EEG e também gravação de vídeo, simultaneamente. E com os experimentos que fazemos, podemos então testar novas estratégias de tratamento, como terapia gênica, para reduzir a frequência, a duração e a gravidade das crises.