La absorción de aminoácidos y el metabolismo son esenciales para la especificación, diferenciación y formación ósea de los osteoblastos. Este protocolo proporciona un método rápido y sensible para evaluar la absorción de aminoácidos. Nuestro protocolo utiliza aminoácidos radiomarcados para cuantificar la absorción de aminoácidos.
Es un método barato, sensible y rápido que se puede modificar fácilmente para diferentes condiciones. Este protocolo se puede modificar fácilmente para evaluar la absorción de otros nutrientes radiomarcados como la glucosa y los ácidos grasos en una variedad de tejidos, así como en células primarias o transformadas. Para comenzar el ensayo de captación de aminoácidos se realiza cinco veces 10 a la cuarta células ST2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos en medio alfa MEM suplementado con FBS, penicilina y estreptomicina.
Placa pozos adicionales de células para cuantificar el número de células por condición para las normalizaciones. A continuación, incube las células en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante dos o tres días hasta que confluya. Después de la incubación, aspirar el medio y lavar las células dos veces con un mililitro de PBS a pH 7.4.
Luego aspire el PBS antes de lavar las células una vez con un mililitro HEPES de Krebs-Ringer o KRH. Incubar células con 0,5 mililitros de KRH recién preparado que contiene cuatro microcuries por mililitro L34 de glutamina tritiada durante cinco minutos. Después de la incubación, recoger el medio radiactivo para dispensar en el contenedor de residuos líquidos.
Luego lave las células tres veces con KRH helado para terminar la reacción. A continuación, agregue un mililitro de dodecil sulfato de sodio al 1% a cada pocillo y triture la mezcla 10 veces para lisar y homogeneizar las células. Luego transfiera los lisados celulares a un tubo de 1.5 mililitros y aclare el lisado centrifugando a una velocidad mínima de 10, 000 G durante 10 minutos.
Transfiera el sobrenadante a un vial de centelleo que contenga ocho mililitros de la solución de centelleo y lea la actividad de radio y los recuentos por minuto utilizando el contador de centelleo. A partir de las placas no radiactivas restantes de las células, tripsinizar, resuspender y contar las células para estimar el número de células en los cultivos radiactivos lisados. Usando un hemacitómetro, cuente el número de células por pocillo no radiactivo para cada condición experimental.
Para determinar la absorción de aminoácidos, enjuague la médula del hueso antes de pesar el eje óseo. Para descelularizar el hueso, hierva un húmero en PBS a 100 grados centígrados durante 10 minutos. Equilibrar los húmeros vivos y hervidos en un mililitro de KRH durante 30 minutos en la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados.
A continuación, incube los huesos de control experimentales y hervidos por separado en KRH recién preparado que contiene cuatro microcurries por mililitro de arginina triciada L234 durante un máximo de 90 minutos a 37 grados centígrados. Después de eliminar el medio radiactivo, termine la reacción lavando el húmero tres veces con un mililitro de KRH helado. Transfiera cada hueso a un tubo de 1,5 mililitros con 500 microlitros de tampón RIPA.
Luego homogeneice el húmero y el tampón RIPA cortando 100 veces con tijeras, seguido de la sonicación al 35% de amplitud y un segundo pulso durante 10 segundos. Clarificó el lisado por centrifugación durante 10 minutos a 10, 000 veces G a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, transfiera 200 microlitros del sobrenadante a viales de centelleo que contengan ocho mililitros de la solución de centelleo.
Lea la actividad de radio usando el contador de centelleo. Se evaluaron las propiedades cinéticas de la captación in vitro de glutamina tritiada L34 y las células ST2 confluentes en presencia o ausencia de ácido metil amino isobutírico de sodio o litio. La eliminación de sodio condujo a una reducción del 90% en la absorción de glutamina.
La presencia de litio aumentó la absorción de glutamina en un 2% en comparación con la condición libre de sodio. Mientras que el ácido metil amino isobutírico no afectó la absorción de glutamina. Las contribuciones porcentuales estimadas del sistema A, N, L o ASC y gamma más L indicaron que la mayor parte de la absorción de glutamina está mediada por los sistemas ASC y gamma más L. El sistema N es responsable de aproximadamente un 2% de absorción de glutamina dependiente de sodio.
Y el sistema A mostró 0% de contribución y aceptación. La captación de arginina tritiada de X-VIVO L34 en húmeros neonatales hervidos y vivos se analizó en un transcurso de dos horas. La absorción de arginina aumentó linealmente a lo largo del experimento y el húmero vivo.
El húmero hervido no exhibió un aumento dinámico de la absorción de arginina en el experimento. El análisis representativo muestra la absorción de arginina normalizada y corregida. Es importante hervir el hueso contralateral como control activo.
Este paso es esencial ya que la matriz ósea puede absorber aminoácidos radiactivos, lo que resulta en resultados inexactos. El protocolo nos ha permitido confirmar la cinética de captación de aminoácidos tanto in vitro como in vivo.
