Este método permite investigar cómo se ve afectado el estado redox mitocondrial en condiciones fisiopatológicas. También se puede utilizar para evaluar la eficacia de las estrategias de tratamiento que tienen como objetivo proteger las mitocondrias. La principal ventaja de esta técnica es que permite una evaluación orgánica y específica de los cambios dinámicos y de rastreo en el estado redox de las mitocondrias en tiempo real.
Este método se puede combinar con indicadores adicionales para registrar simultáneamente, por ejemplo, el potencial de la membrana mitocondrial o las concentraciones de calcio además del estado redox. Este protocolo se puede aplicar a células de cultivo, explantes de tejidos y cultivos de rodajas. Comience por optimizar la configuración del microscopio confocal de barrido.
Para hacerlo, configure el detector en 12 bits o 16 bits, active el modo de escaneo secuencial y agregue una segunda secuencia / pista. Para ambos canales, seleccione una tabla de búsqueda de pseudo color que indique píxeles sobreexpuestos y subexpuestos y, a continuación, seleccione un objetivo adecuado para el objeto de interés. Monte un coverslip con células en la cámara de imágenes.
Agregue un mililitro de tampón de imágenes y coloque la cámara en el microscopio. Use el ocular y la luz transmitida para enfocar las células. Grabe imágenes con diferentes formatos de píxeles y tamaños estenopeicos.
Luego grabe imágenes con diferentes intensidades láser y, en consecuencia, ajuste la ganancia y el umbral del detector. Finalmente, grabe imágenes con diferentes velocidades de escaneo y diferentes números de promedios de fotogramas. Para obtener imágenes en vivo, establezca el intervalo de lapso de tiempo en 30 segundos y la duración en 25 minutos.
Luego monte las células, coloque la cámara en el microscopio y enfoque las células como se demostró anteriormente. Cambie al modo de escaneo y use el canal de 488 nanómetros en la vista en vivo para enfocar y localizar las células para obtener imágenes. Opcionalmente, para aumentar el número de celdas grabadas por ejecución, utilice la función multipunto para obtener imágenes de dos a tres campos de visión por recubierta.
Inicie la adquisición de lapso de tiempo y grabe cinco imágenes como una grabación de línea de base de dos minutos. Agregue 500 microlitros de solución 3X NMDA a la cámara para lograr la concentración final de 30 micromolares y registre 20 imágenes adicionales como una respuesta NMDA de 10 minutos. A continuación, agregue 500 microlitros de solución 4X DA a la cámara y grabe seis imágenes más.
Aspire el tampón de la cámara de imágenes y reemplácelo con un mililitro de solución de TDT. Después de grabar 10 imágenes más, finalice la grabación y guarde la serie de imágenes. Para importar los datos en el software de análisis de imágenes, haga clic en complementos, seleccione formatos de biografía y luego en el importador de formatos de biografía.
En el cuadro de diálogo, elija hyperstack en la pila de vistas con, establezca el modo de color como predeterminado y seleccione escala automática. Cambie el formato de la imagen a 32 bits haciendo clic en la imagen, seleccionando tipo y, a continuación, de las opciones, elija 32 bits. Para dividir los canales de color en ventanas separadas, haga clic en la imagen, vaya a color y seleccione dividir canales.
Ajuste el umbral para seleccionar las mitocondrias para el análisis haciendo clic en la imagen, seleccionando ajustar y el umbral. En el cuadro de diálogo, seleccione fondo oscuro rojo predeterminado y histograma de pila. Cuando los píxeles seleccionados aparezcan en rojo, haga clic en aplicar.
A continuación, seleccione establecer píxeles de fondo para que NAN procese todas las imágenes y realice el mismo procedimiento para el canal dos. Para visualizar la relación de 405 a 488 nanómetros, cree una imagen de proporción haciendo clic en la calculadora de procesos e imágenes. En el cuadro de diálogo, seleccione canal uno en la imagen una división en el canal de operación dos en la imagen dos.
A continuación, seleccione crear nueva ventana y procese todas las imágenes. Cambie la tabla de búsqueda de la imagen de relación a pseudo color haciendo clic en la imagen, seleccionando tablas de búsqueda y, a continuación, dispare. Para analizar la imagen, dibuje ROI alrededor de células individuales o mitocondrias en la imagen de proporción.
Para agregar los ROI al administrador de ROI, vaya a analizar, haga clic en las herramientas, seleccione el administrador de ROI, haga clic en agregar y seleccione mostrar todo. Para medir las proporciones de 405 a 488 nanómetros de celdas individuales, haga clic en el administrador de ROI, seleccione todos los ROI presionando Control A, vaya a más y seleccione multimedida. En el cuadro de diálogo, seleccione medir todos los sectores y una fila por sector.
Después de exportar las mediciones al software de hoja de cálculo, seleccione la imagen de 405 nanómetros, mida las intensidades de todos los ROI y vuelva a exportar las mediciones al software de hoja de cálculo. Del mismo modo, mida las intensidades de ROI de la imagen de 488 nanómetros. Para guardar los ROI para futuras referencias, seleccione todos los ROI presionando Control A, vaya a más y seleccione guardar.
Estas instantáneas representativas de una grabación de lapso de tiempo muestran imágenes de relación de neuronas antes y después del tratamiento con NMDA y después de la calibración máxima / min con DA y TDT. El tratamiento de las neuronas con NMDA 30 micromolares indujo la oxidación de las mitocondrias en pocos minutos. El análisis de los canales de fluorescencia individuales reveló que la acidosis mitocondrial inducida por NMDA causó una caída de la fluorescencia GFP en la excitación de 405 y 488 nanómetros.
En un experimento de control, el pretratamiento con DA impidió cualquier oxidación adicional de las mitocondrias por NMDA. Y en consecuencia, la relación 405 a 488 no cambió a pesar de un enfriamiento considerable de la intensidad de fluorescencia GFP2 sensible al redox. Este experimento confirmó que la relación de 405 a 488 nanómetros no se ve afectada por los cambios de pH.
En un experimento separado, el potencial de membrana mitocondrial, el estado redox y la morfología se evaluaron en paralelo. El tratamiento de las neuronas con NMDA micromolar de 60 resultó en la pérdida de la señal de tetrametilrodamina o TMRE y un aumento en la relación de GFP rho de 405 a 488 nanómetros seguida de un redondeo tardío de las mitocondrias. Cuando comience a usar este método, es muy importante tomarse el tiempo para optimizar cuidadosamente la configuración microscópica.
Esto ayudará a mantener las neuronas sanas durante sus experimentos. También es muy importante respetar siempre las normas de seguridad láser. Asegúrese de no exponerse a la radiación láser cuando agregue medicamentos para manipular durante las grabaciones en vivo.
