Este protocolo maximiza en gran medida el poder de la microscopía como método para rastrear la dinámica mitocondrial dentro de las células individuales durante largos períodos de adquisición. A diferencia del lapso de tiempo en un grupo fijo de células, o en una célula a la vez, la normalización a una línea de base para cada criterio medido en cada célula controla la heterogeneidad entre las células. Con un microscopio equipado con plataforma automatizada y vector viral adaptado, podemos utilizar este protocolo para todo tipo de células.
Comience por emplatar de 20, 000 a 25, 000 células por centímetro cuadrado en platos de múltiples pozos y guárdelos a 37 grados centígrados bajo una atmósfera que contenga 5% de dióxido de carbono para el resto del experimento. A los ocho días in vitro, añadir 0,6 pico gramos de antígeno P24 por célula del vector lentiviral que codifica para el biosensor mitocondrial MitoTimer diluido en solución salina tamponada con fosfato. A los 11 días in vitro, realizar dos lavados con PBS estéril precalentado y añadir medio de astrocito fresco sin rojo fenol.
Evaluar el sistema mitocondrial astrocítico al menos de tres a cinco días después de las infecciones lentivirales con LV-G1 MitoTimer. Seleccione cinco astrocitos por pozo con una red mitocondrial que exprese niveles suficientes de LV-G1 MitoTimer utilizando un aumento de 40 veces. Tener cuidado de seleccionar astrocitos planos y grandes como sea posible y no ubicados en grupos de células.
Luego capture imágenes de fluorescencia utilizando excitación secuencial a 490 nanómetros para el canal verde y 550 nanómetros para el canal rojo con señales fluorescentes verdes y rojas y utilizando un aumento de 150 veces para cada coordenada. Seleccione el primer fotograma para los canales rojo y verde para cada secuencia de imágenes haciendo clic en Procesamiento ND y seleccione el fotograma. A continuación, fusione los canales rojo y verde seleccionando conversiones y fusione el canal.
Para corregir el sombreado de imagen, seleccione preprocesamiento y, a continuación, corrección automática de sombreado. Aplique el algoritmo de bola rodante seleccionando preprocesamiento y bola rodante. Para generar máscaras binarias para cada mitocondria, seleccione segmentación y umbral.
Elimine los objetos truncados por el borde seleccionando procesamiento binario y tocando el borde. Seleccione la medida y, a continuación, el área del objeto, el diámetro, la longitud, el ancho, la rugosidad, la circularidad o el alargamiento para medir el área de superficie, el diámetro, la longitud, el ancho, la rugosidad, la circularidad o el alargamiento, respectivamente. Componga un grupo con estas medidas y cámbiele el nombre como datos MOFO.
A continuación, seleccione la medición y, a continuación, seleccione la intensidad media para medir las intensidades medias verde y roja. Y ratio para medir la ratio rojo por verde. Ahora el compositor agrupa con estas medidas y renombra como datos de proporción.
Finalmente, exporte la tabla a un archivo CSV seleccionando referencia y tabla a CSV, y luego guarde el script de análisis GA 3 seleccionando Guardar como.Comience abriendo el módulo de seguimiento en NIS y seleccionando vista, análisis y seguimiento. Haga clic en definir nuevo ROI. Con la herramienta de detección automática, seleccione de 25 a 50 mitocondrias en la primera imagen de la secuencia de imágenes y luego haga clic en rastrear el análisis de ROI detectados automáticamente.
Si es necesario, elimine las pistas de ROI incorrectas y exporte la tabla a un archivo CSV. Registre manualmente la transformación de las mediciones antes de procesarlas. Para cada análisis y marco de tiempo, normalice manualmente los datos resultantes por la media obtenida en la adquisición de referencia.
A continuación, realice un análisis estadístico utilizando un Nova emparejado de dos vías. El cultivo primario de astrocitos infectados con LV-G1 MitoTimer exhibió redes mitocondriales equilibradas y oxidadas reducidas con diferentes niveles de fragmentación. Antes del tratamiento con peróxido de hidrógeno, los astrocitos que expresaban LV-G1 MitoTimer mostraron un tamaño mitocondrial heterogéneo en varias intensidades de fluorescencia verde y roja.
La morfología mitocondrial de los cultivos de astrocitos se fragmentó después de seis horas de incubación con peróxido de hidrógeno. Fue aún más evidente 12 horas después del tratamiento sin sus diámetros con reducción de la esfericidad. En cuanto al estado redox y el recambio, tres horas después de un tratamiento con peróxido de hidrógeno, la proporción de mitocondrias verdes aumentó en los astrocitos.
Respecto a la dinámica y movilidad tres horas después del tratamiento. Todos los criterios se incrementaron transitoriamente. Esta técnica es adecuada para muchas preguntas diferentes.
Por ejemplo, en el contexto de la enfermedad neurodegenerativa, estamos investigando la toxicidad estrocítica de diferentes moléculas secretadas en el cerebro.
