Como um poderoso modelo animal em estudos neurodegenerativos e comportamentais, os C.elegans podem ser usados para rastrear e avaliar eficientemente compostos tóxicos contra a neurotoxicidade da poliglutamina usando modelos semelhantes à doença de Huntington. A principal vantagem dessa técnica é o perfil e a integração de vários fenótipos em diferentes modelos de C.elegans. Também na verdade, como modelos C.elegans são usados neste método.
Ele fornece tamanho para a triagem e a investigação de candidatos terapêuticos para outros atrasos neurodegenerativos e, de fato, outros atrasos. Preste atenção às temperaturas utilizadas no crescimento de C.elegans e realize o teste nos estágios certos do desenvolvimento namínico. Demonstrando o procedimento estarão Jiang Yiyi, Xioa Yue e Wang Qiangqiang, três estudantes de pós-graduação.
Comece transferindo 300 a 500 larvas L1 sincronizadas de nematoides AM141 para cada poço de uma placa de 48 poços com 500 microliters de S médio contendo cepa OP50 de E.coli e cinco miligramas por mililitro de astragalano. Sele a placa com parafilm e incubar a 20 graus Celsius e 120 rotações por minuto para intervalos de tempo desejados. Transfira os nematoides em um tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro e lave com tampão M9 três vezes por centrifugação para remover as células OP50 restantes.
Em seguida, resuspenque os nematoides AM141 no buffer M9. Agora, transfira de 10 a 15 nematoides em cada poço em uma placa de 384 poços, estabelecendo 10 poços de réplica para cada tratamento e adicione 10 microliters de 200 milimoslar de azida de sódio a cada poço para paralisar os nematoides, permitindo que eles se acomodem até o fundo. Coloque a placa em um sistema de imagem de alto teor para adquirir imagens fluorescentes.
Abra o software de aquisição de imagens e configure os parâmetros mencionados no manuscrito do texto. Analise os dados da imagem abrindo a janela de dados da placa de revisão e selecionando a placa de teste para análise de imagens. Clique duas vezes em um teste bem para exibir sua imagem.
Em seguida, selecione os núcleos de contagem como o método de análise e clique no botão configurar configurações. Defina a imagem de origem do canal FITC e selecione o algoritmo padrão. Defina os parâmetros de análise de imagem conforme descrito no manuscrito do texto e teste-os para otimizar o método de análise.
Salve as configurações e execute a análise em todos os poços. Exporte os núcleos totais como o número total de agregados q40:YFP em cada poço. Conte o número de nematoides em cada poço e calcule o número médio de agregados Q40:YFP por nematoide em cada grupo.
Então, calcule o índice de inibição. Para preparar nematoides para o ensaio de neurotoxicidade de polq, transfira 300 a 500 larvas L1 sincronizadas de nematoides HA759 para cada poço de uma placa de 48 poços com 500 microlitradores de S médio contendo cepa OP50 de E.coli e cinco miligramas por mililitro de astragalano. Após selar as placas, incubar, colher e resuspendar os nematoides no tampão M9, como demonstrado anteriormente.
Agora, prepare-se em agarose pad adicionando dois gramas de agarose a 100 mililitros de tampão M9 e aqueça a solução em um micro-ondas para quase ferver. Dispense 0,5 mililitros de agarose derretido no centro de um deslizamento de vidro de microscopia de um milímetro de espessura colocado entre dois pedaços de placas de vidro de dois milímetros de espessura, cobrindo com outro slide verticalmente. Remova suavemente o slide superior quando a agarose esfriar e se solidificar.
Inicie o ensaio de sobrevivência neuronal ASH adicionando uma gota de 20 milimônios de azida de sódio na almofada agros e, em seguida, transferindo 15 a 20 nematoides HA759 para a queda para imobilizá-los. Coloque um deslizamento de cobertura suavemente sobre os nematoides. Agora, mantenha o slide sob um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera digital.
Selecione uma lente objetiva de 40x e filtro FITC para detectar neurônios ASH positivos GFP na região principal dos nematoides. Selecione mais de 50 nematoides em cada grupo aleatoriamente para contar o número de nematoides com neurônios ASH bilaterais rotulados por GFP em sua região principal e, em seguida, calcular a taxa de sobrevivência dos neurônios ASH. Para o ensaio de prevenção osmótica, divida uma placa NGM livre de alimentos em zonas normais e de armadilha, criando uma linha de glicerol molar no meio.
Em seguida, espalhe uma linha de azida de sódio de 200 milialar a cerca de um centímetro de distância da linha do glicerol para paralisar os nematoides que atravessam a barreira do glicerol até a zona de armadilha. Transfira cerca de 200 nematoides cada um para a zona normal de três placas de réplica para cada grupo. Em seguida, adicione uma queda de 1% butanedione na zona de armadilha para atrair os nematoides.
Cubra a tampa da placa de Petri imediatamente e incubar a 23 graus Celsius por 90 minutos. Marque o número de nematoides em ambas as zonas sob um microscópio e calcule o índice de evasão. A cepa de poliq transgênico AM141 expressa fortemente proteínas de fusão Q40:YFP em suas células musculares da parede corporal, identificadas por este protocolo automatizado de imagem e análise, cuja quantidade crescente foi inibida pelo tratamento astragalano demonstrando seu potencial protetor.
A perda de fluorescência GFP e neurônios ash bilaterais nas regiões da cabeça de nematoides indica a morte neuronal ash. Este ensaio de sobrevivência neuronal ASH pode ser usado para avaliar visualmente o efeito neuroprotetor de compostos de teste em neurônios de elegância de Caenorhabditis. O ensaio de evasão de quimioensory foi usado para examinar as amostras de teste eficazes sobre a perda funcional de neurônios ASH mediados pela agregação de polq.
O índice de evasão de nematoides HA759 tratados com astragalano a 15 graus Celsius por três dias aumentou para mais de 0,6, demonstrando um efeito neuroprotetor do polissacarídeo contra prejuízos comportamentais. Para avaliar a capacidade neuroprotetora geral dos compostos de teste, os dados dos ensaios individuais foram integrados e apresentados como um gráfico de radar mostrando a área do triângulo no grupo de tratamento astragalano maior que a do grupo controle, indicando os efeitos anti-polícnico do polissacarídeo. Por favor, tenha em mente que comida, temperatura e umidade podem afetar seu comportamento de C.elegans.
