В качестве мощной животной модели в нейродегенеративных и поведенческих исследованиях, C.elegans может быть использован для эффективного скрининга и оценки токсичных соединений против нейротоксичности полиглутамина с использованием моделей, подобных болезни Гентингтона. Основным преимуществом данной методики является профилирование и интеграция нескольких фенотипов в разные модели C.elegans. Также на самом деле, как и C.elegans, в этом методе используются модели.
Он обеспечивает размер скрининга и исследования терапевтических кандидатов для других нейродегенеративных задержек и других задержек. Пожалуйста, обратите внимание на температуры, используемые при росте C.elegans, и выполните тест на правильных стадиях разработки. Демонстрировать процедуру будут Цзян Ии, Сиоа Юэ и Ван Цянцян, три аспиранта.
Начните с переноса от 300 до 500 синхронизированных личинок L1 нематод AM141 в каждую лунку 48-луночной пластины с 500 микролитрами среды S, содержащей штамм OP50 E.coli и пять миллиграммов на миллилитр астрагалана. Запечатайте пластину парапленкой и инкубируйте при 20 градусах Цельсия и 120 оборотах в минуту в течение желаемых временных интервалов. Переложите нематод в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и трижды промыть буфером M9 центрифугированием для удаления оставшихся клеток OP50.
Затем повторно суспендируйте нематод AM141 в буфере M9. Теперь перенесите от 10 до 15 нематод в каждую скважину в 384 луночной пластине, установив 10 реплицированных лунок для каждой обработки и добавьте 10 микролитров 200 миллимолярного азида натрия в каждую скважину, чтобы парализовать нематод, позволив им осесть на дно. Поместите пластину в систему визуализации с высоким содержанием для получения флуоресцентных изображений.
Откройте программное обеспечение для получения изображений и настройте параметры, указанные в текстовой рукописи. Проанализируйте данные изображения, открыв окно данных обзорной пластины и выбрав тестовую пластину для анализа изображения. Дважды щелкните по пробной скважине, чтобы отобразить ее изображение.
Затем выберите число ядер в качестве метода анализа и нажмите на кнопку настройки параметров. Определите исходное изображение из канала FITC и выберите стандартный алгоритм. Задайте параметры анализа изображений, как описано в тексте рукописи, и протестируйте их для оптимизации метода анализа.
Сохраните настройки и запустите анализ на всех скважинах. Экспортируйте общее количество ядер как общее количество агрегатов Q40:YFP в каждой скважине. Подсчитайте количество нематод в каждой скважине и рассчитайте среднее количество агрегатов Q40:YFP на нематоду в каждой группе.
Затем рассчитайте индекс торможения. Для подготовки нематод к анализу нейротоксичности polyQ переносят от 300 до 500 синхронизированных личинок L1 нематод HA759 в каждую лунку 48-луночной пластины с 500 микролитрами среды S, содержащей штамм OP50 E.coli и пять миллиграммов на миллилитр астрагалана. После запечатывания пластин инкубируйте, собирайте и повторно суспендируйте нематод в буфере M9, как было продемонстрировано ранее.
Теперь приготовьте в агарозной прокладке, добавив два грамма агарозы к 100 миллилитрам буфера M9 и нагрейте раствор в микроволновой печи почти до кипения. Нанесите 0,5 миллилитра расплавленной агарозы на центр микроскопического стеклянного слайда толщиной в один миллиметр, помещенного между двумя кусками стеклянных пластин толщиной в два миллиметра, покрывая еще одним слайдом вертикально. Аккуратно снимите верхнюю горку, как только агароза остынет и затвердеет.
Начните анализ выживания нейронов ASH, добавив каплю 20 миллимолярного азида натрия на подушечку агроса, а затем переместив от 15 до 20 нематод HA759 в каплю, чтобы обездвижить их. Аккуратно положите крышку поверх нематод. Теперь держите затвор под флуоресцентным микроскопом, оснащенным цифровой камерой.
Выберите объектив 40x и фильтр FITC для обнаружения GFP-положительных нейронов ASH в области головы нематод. Выберите более 50 нематод в каждой группе случайным образом, чтобы подсчитать количество нематод с GFP-мечеными двусторонними нейронами ASH в области головы, а затем рассчитать выживаемость нейронов ASH. Для анализа осмотического избегания разделите пластину NGM без пищи на нормальные и ловушковые зоны, создав восьмимолярную глицериновую линию посередине.
Затем распределите 200-миллимолярную линию азида натрия на расстоянии около одного сантиметра от линии глицерина, чтобы парализовать нематод, пересекающих глицериновый барьер в зону ловушки. Перенесите около 200 нематод каждая в нормальную зону трех реплицированных пластин для каждой группы. Затем добавьте каплю 1% бутандиона в зону ловушки, чтобы привлечь нематод.
Сразу же накройте крышку чашки Петри и высиживайте при 23 градусах Цельсия в течение 90 минут. Оцените количество нематод в обеих зонах под микроскопом и рассчитайте индекс избегания. Трансгенный штамм polyQ AM141 сильно экспрессирует белки слияния Q40: YFP в мышечных клетках стенки тела, идентифицированных этим автоматизированным протоколом визуализации и анализа, увеличение количества которых было ингибировано лечением астрагаланом, демонстрирующим его защитный потенциал.
Потеря флуоресценции GFP и двусторонних нейронов ASH в областях головы нематод указывает на гибель нейронов ASH. Этот анализ выживания нейронов ASH может быть использован для визуальной оценки нейропротекторного эффекта тестовых соединений на нейроны элегантности Caenorhabditis. Хемосенсорный анализ избегания использовался для изучения эффективных тестовых образцов на функциональную потерю нейронов ASH, опосредованную агрегацией polyQ.
Индекс избегания нематод HA759, получавших астрагалан при 15 градусах Цельсия в течение трех дней, увеличился до более чем 0,6, демонстрируя нейропротекторное действие полисахарида против поведенческих нарушений. Для оценки общей нейропротекторной способности исследуемых соединений данные отдельных анализов были интегрированы и представлены в виде радиолокационной диаграммы, показывающей площадь треугольника в группе лечения астрагаланом, большую, чем у контрольной группы, что указывает на антиполиQ эффекты полисахарида. Пожалуйста, имейте в виду, что пища, температура и влажность могут повлиять на их поведение C.elegans.
