Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la terapia de microARN al riñón, lo que sigue siendo un desafío. La principal ventaja de esta técnica es que permite la terapia de microARN que imita al riñón sin causar una respuesta de interferón o inestabilidad genética. Comience disolviendo 10 microlitros de PEI-NP en 90 microlitros de solución de glucosa al 5% en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros.
Luego vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo. Mezclar 50 microlitros de miRNAs sintetizados artificialmente disueltos en 100 micromolares de agua libre de nucleasa con 50 micromolares de solución de glucosa al 10% en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.
Este proceso produce miARN disuelto en solución de glucosa al 5%. Luego mezcle 100 microlitros de PEI-NP en solución de glucosa al 5% y 100 microlitros de miRNA imitan en una solución de glucosa al 5%. Vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.
Incubar la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente para preparar un complejo estable de imitación de miARN PEI-NPs. Disuelva dos microlitros de PEI-NP en 98 microlitros de solución de glucosa al 10% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.
Luego agregue 100 microlitros de imitación de miARN marcado con Cy3 a 100 microlitros de PEI-NP en solución de glucosa al 10% y vortice el tubo suavemente. Incubar la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente para preparar un complejo estable de imitador de miARN marcado con PEI-NPs-Cy3. Coloque el ratón UUO de cabeza en un tubo de centrífuga de 50 mililitros sin anestesia y luego coloque la cola a través de un orificio preparado en la tapa.
Llene una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 30 con 200 microlitros de complejo imitador de miARN marcado con PEI-NPs-Cy3 e inyecte el complejo a través de la vena de la cola del ratón. Luego, haga una incisión en la piel, los músculos y las costillas con tijeras quirúrgicas y fórceps para exponer el corazón. Después de hacer una incisión en la aurícula derecha, inyecte PBS en el ventrículo izquierdo hasta que el color del riñón cambie a amarillo pálido.
Esto indica que todo el cuerpo del ratón está perfundido con PBS. Después de recolectar los riñones, retire las cápsulas renales y lávelas dos veces con PBS. Incruste las muestras de tejido renal en un compuesto OCT y congélelas en nitrógeno líquido.
Use un criostato para preparar secciones y monte las secciones en portaobjetos de vidrio recubiertos de silano. Fíjelos con paraformaldehído al 4% y lave suavemente los portaobjetos dos veces con PBS. Finalmente, visualice la tinción de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia con un aumento de 100x y 400x y el software de imágenes apropiado.
La imagen representativa muestra la estructura del complejo PEI-NPs-miRNA-imitador. La administración y los efectos de miRNA-146a-5p-imitan usando PEI-NPs en la fibrosis renal se representan en estas imágenes. El análisis de microscopía fluorescente mostró que la inyección de PEI-NP en la vena de la cola podría administrar el miARN imitador al espacio tubulointersticial.
En ratones con fibrosis renal producidos por UUO, esto incluyó células tubulares renales que no tienen una forma regular en el riñón y el glomérulo. El análisis qRT-PCR mostró que la inyección de PEI-NPs-miRNA-146a-5p-imitador indujo una sobreexpresión significativa de miRNA-146a-5p en el riñón. El análisis histológico con tinción de rojo Sirius se muestra aquí.
El análisis de microscopía fluorescente mostró que la inyección de PEI-NP en la vena de la cola podría administrar miRNA imitador al glomérulo y al espacio tubulointersticial en riñones de ratones modelo de riñón diabético in vivo. Además, el análisis qRT-PCR mostró que la inyección de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-imitador indujo una sobreexpresión significativa de miRNA-181b-5p en el riñón. El análisis histológico con tinción periódica de ácido-Schiff mostró que la inyección de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-imitador una vez por semana de 10 a 20 semanas de edad inhibió la progresión de la enfermedad renal diabética en ratones.
Aquí se muestran la administración y los efectos de PEI-NPs-miRNA-5100-mimic en ratones modelo de lesión renal aguda producidos por lesión por isquemia reperfusión. En estas imágenes se representan los datos del análisis de microscopía fluorescente qRT-PCR para evaluar los efectos de sobreexpresión de miRNA-5100 después de la inyección de PEI-NPs-miRNA-5100-mimic y el análisis histológico del riñón teñido con hematoxilina-eosina. Los PEI-NP inyectados a través de la vena de la cola dos días antes del procedimiento de lesión por isquemia reperfusión, o IRI, previenen la progresión de la lesión renal aguda inducida por IRI.
Al realizar esta técnica, prepare secciones de cinco micrómetros de espesor que incluyan la mayor cantidad de tejido renal posible. También puede preparar secciones de siete micrómetros de espesor.
