Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella terapia del microRNA al rene, che rimane una sfida. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ha permesso la terapia dei microRNA imitando il rene senza causare una risposta all'interferone o instabilità genetica. Iniziare sciogliendo 10 microlitri di PEI-NPs in 90 microlitri di soluzione di glucosio al 5% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Quindi vortice delicatamente il tubo e girare verso il basso. Mescolare 50 microlitri di miRNA sintetizzati artificialmente disciolti in 100 micromolari di acqua priva di nucleasi con 50 micromolari di soluzione di glucosio al 10% in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.
Questo processo produce miRNA disciolti in una soluzione di glucosio al 5%. Quindi mescolare 100 microlitri di PEI-NPs in soluzione di glucosio al 5% e 100 microlitri di miRNA mimic in soluzione di glucosio al 5%. Vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.
Incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente per preparare un complesso stabile di miRNA PEI-NPs. Sciogliere due microlitri di PEI-NP in 98 microlitri di soluzione di glucosio al 10% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.
Quindi aggiungere 100 microlitri di miRNA marcati con Cy3 a 100 microlitri di PEI-NPs in soluzione di glucosio al 10% e vortice delicatamente il tubo. Incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente per preparare un complesso stabile di PEI-NPs-Cy3-marcato-miRNA-mimic. Posizionare il topo UUO a testa in giù in un tubo da centrifuga da 50 millilitri senza anestesia e quindi posizionare la coda attraverso un foro preparato nel cappuccio.
Riempire una siringa da un millilitro con un ago calibro 30 con 200 microlitri di complesso miRNA-mimico marcato con PEI-NPs-Cy3 e iniettare il complesso attraverso la vena caudale del topo. Successivamente, praticare un'incisione nella pelle, nei muscoli e nelle costole con forbici chirurgiche e pinze per esporre il cuore. Dopo aver praticato un'incisione nell'atrio destro, iniettare PBS nel ventricolo sinistro fino a quando il colore del rene diventa giallo pallido.
Ciò indica che l'intero corpo del mouse è perfuso con PBS. Dopo aver raccolto i reni, rimuovere le capsule renali e lavarle due volte con PBS. Incorporare i campioni di tessuto renale nel composto OCT e congelarli in azoto liquido.
Utilizzare un criostato per preparare le sezioni e montare le sezioni su vetrini rivestiti di silano. Fissarli con il 4% di paraformaldeide e lavare delicatamente i vetrini due volte con PBS. Infine, visualizzare la colorazione a fluorescenza mediante microscopia a fluorescenza con ingrandimento 100x e 400x e software di imaging appropriato.
L'immagine rappresentativa mostra la struttura del complesso PEI-NPs-miRNA-mimimi. La consegna e gli effetti di miRNA-146a-5p-mimic utilizzando PEI-NPs nella fibrosi renale sono rappresentati in queste immagini. L'analisi al microscopio fluorescente ha mostrato che l'iniezione di PEI-NP potrebbe fornire la mimica miRNA allo spazio tubulointerstiziale.
Nei topi con fibrosi renale prodotti da UUO, questo includeva cellule tubulari renali che non hanno una forma regolare nel rene e nel glomerulo. L'analisi qRT-PCR ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic ha indotto una significativa sovraespressione di miRNA-146a-5p nel rene. L'analisi istologica con colorazione rossa Sirio è mostrata qui.
L'analisi al microscopio fluorescente ha mostrato che l'iniezione di PEI-NP potrebbe fornire miRNA mimic al glomerulo e allo spazio tubulointerstiziale nei reni di topi modello di rene diabetico in vivo. Inoltre, l'analisi qRT-PCR ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic ha indotto una significativa sovraespressione di miRNA-181b-5p nel rene. L'analisi istologica con colorazione periodica acido-Schiff ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic una volta alla settimana da 10 a 20 settimane di età ha inibito la progressione della malattia renale diabetica nei topi.
La consegna e gli effetti di PEI-NPs-miRNA-5100-mimic in topi modello di danno renale acuto prodotti da danno da ischemia da riperfusione sono mostrati qui. In queste immagini sono illustrati i dati dell'analisi al microscopio fluorescente qRT-PCR per valutare gli effetti di sovraespressione di miRNA-5100 dopo iniezione di PEI-NPs-miRNA-5100-mimic e l'analisi istologica del rene colorato con ematossilina-eosina. Le PEI-NP iniettate attraverso la vena caudale due giorni prima della procedura di danno da riperfusione da ischemia, o IRI, prevengono la progressione del danno renale acuto indotta dall'IRI.
Quando si esegue questa tecnica, preparare sezioni spesse cinque micrometri che includano più tessuto renale possibile. Puoi anche preparare sezioni spesse sette micrometri.
