Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na terapia de microRNA para o rim, que permanece um desafio. A principal vantagem dessa técnica é que ela possibilitou a terapia de microRNA imita o rim sem causar uma resposta de interferon ou instabilidade genética. Comece dissolvendo 10 microlitros de PEI-NPs em 90 microlitros de solução de glicose a 5% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo. Misturar 50 microlitros de miRNAs sintetizados artificialmente dissolvidos em 100 micromolares de água livre de nucleases com 50 micromolares de solução de glicose a 10% em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
Este processo produz miRNA dissolvido em solução de glicose a 5%. Em seguida, misturar 100 microlitros de PEI-NPs em solução de glicose a 5% e 100 microlitros de miRNA mimetizar em solução de glicose a 5%. Vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
Incubar a mistura por 15 minutos à temperatura ambiente para preparar um complexo estável de miRNA de PEI-NPs. Dissolver dois microlitros de PEI-NPs em 98 microlitros de solução de glicose a 10% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
Em seguida, adicione 100 microlitros de miRNA marcado com Cy3 a 100 microlitros de PEI-NPs em solução de glicose a 10% e vomite o tubo suavemente. Incubar a mistura por 15 minutos à temperatura ambiente para preparar um complexo estável de PEI-NPs-Cy3-marcado-miRNA-mimic. Coloque o rato UUO de cabeça num tubo centrífugo de 50 mililitros sem anestesia e, em seguida, coloque a cauda através de um orifício preparado na tampa.
Encha uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 30 com 200 microlitros do complexo PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-mimic e injete o complexo através da veia da cauda do rato. Em seguida, faça uma incisão na pele, músculos e costelas com tesoura cirúrgica e pinça para expor o coração. Depois de fazer uma incisão no átrio direito, injete PBS no ventrículo esquerdo até que a cor do rim mude para amarelo pálido.
Isso indica que todo o corpo do mouse está perfundido com PBS. Depois de coletar os rins, remova as cápsulas renais e lave-as duas vezes com PBS. Incorporar as amostras de tecido renal em composto OCT e congelá-los em nitrogênio líquido.
Use um criostato para preparar seções e monte as seções em lâminas de vidro revestidas de silano. Fixe-os com paraformaldeído a 4% e lave suavemente as lâminas duas vezes com PBS. Finalmente, visualizar a coloração de fluorescência por microscopia de fluorescência em aumentos de 100x e 400x e software de imagem apropriado.
A imagem representativa mostra a estrutura do complexo PEI-NPs-miRNA-mimetismo. A liberação e os efeitos do miRNA-146a-5p-mimetismo usando PEI-NPs na fibrose renal são descritos nessas imagens. A análise por microscopia fluorescente mostrou que a injeção de PEI-NPs na veia caudal pode entregar o miRNA mimico ao espaço túbulo-intersticial.
Em camundongos com fibrose renal produzida por UUO, isso incluiu células tubulares renais que não têm uma forma regular no rim e no glomérulo. A análise de qRT-PCR mostrou que a injeção de PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic induziu uma superexpressão significativa de miRNA-146a-5p no rim. A análise histológica com coloração Sirius red é mostrada aqui.
A análise de microscopia fluorescente mostrou que a injeção na veia caudal de PEI-NPs pode entregar miRNA mimético ao glomérulo e ao espaço túbulo-intersticial em rins de camundongos modelo de rim diabético in vivo. Além disso, a análise de qRT-PCR mostrou que a injeção de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic induziu superexpressão significativa de miRNA-181b-5p no rim. A análise histológica com coloração de ácido periódico-Schiff mostrou que a injeção de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimetizam uma vez por semana de 10 a 20 semanas de idade inibiu a progressão da doença renal diabética em camundongos.
A liberação e os efeitos de PEI-NPs-miRNA-5100-mimic em camundongos modelo de lesão renal aguda produzidos por lesão de isquemia e reperfusão são mostrados aqui. Os dados da análise de microscopia fluorescente qRT-PCR para avaliar os efeitos de superexpressão de miRNA-5100 após injeção de PEI-NPs-miRNA-5100-mimic e a análise histológica do rim corado com hematoxilina-eosina são mostrados nessas imagens. NP-IPE injetadas pela veia caudal dois dias antes da lesão de isquemia-reperfusão, ou IRI, impedem a progressão da lesão renal aguda induzida pela IRI.
Ao realizar essa técnica, prepare cortes de cinco micrômetros de espessura que incluam o máximo de tecido renal possível. Você também pode preparar seções de sete micrômetros de espessura.
