Bu yöntem, mikroRNA'nın böbreğe tedavisinde anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir, bu da bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu tekniğin temel avantajı, interferon yanıtına veya genetik instabiliteye neden olmadan mikroRNA taklitlerinin böbreğe tedavisini mümkün kılmasıdır. 10 mikrolitre PEI-NP'yi, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 90 mikrolitre% 5 glikoz çözeltisi içinde çözerek başlayın.
Sonra tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün. 100 mikromolar nükleaz içermeyen suda çözünmüş 50 mikrolitre yapay olarak sentezlenmiş miRNA'yı, 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde 50 mikromolar% 10 glikoz çözeltisi ile karıştırın. Tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.
Bu işlem,% 5 glikoz çözeltisi içinde çözünmüş miRNA verir. Daha sonra 100 mikrolitre PEI-NP'yi% 5 glikoz çözeltisinde ve% 5 glikoz çözeltisinde 100 mikrolitre miRNA taklidi karıştırın. Tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.
Kararlı bir PEI-NP miRNA taklidi kompleksi hazırlamak için karışımı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. İki mikrolitre PEI-NP'yi, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 98 mikrolitre% 10 glikoz çözeltisi içinde çözün. Tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.
Daha sonra,% 10 glikoz çözeltisinde 100 mikrolitre PEI-NP'ye 100 mikrolitre Cy3 etiketli miRNA taklidi ekleyin ve tüpü yavaşça vorteksleyin. Kararlı bir PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-mimik kompleksi hazırlamak için karışımı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. UUO fareyi anestezi olmadan 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve ardından kuyruğu kapaktaki hazırlanmış bir delikten yerleştirin.
Bir mililitrelik bir şırıngayı 200 mikrolitre PEI-NPs-Cy3-etiketli-miRNA-mimik kompleksi ile 30 gauge bir iğne ile doldurun ve kompleksi farenin kuyruk damarından enjekte edin. Daha sonra, kalbi açığa çıkarmak için cerrahi makas ve forseps ile cilde, kaslara ve kaburgalara bir kesi yapın. Sağ atriyuma bir kesi yaptıktan sonra, böbrek rengi soluk sarıya dönene kadar PBS'yi sol ventriküle enjekte edin.
Bu, tüm fare gövdesinin PBS ile perfüze edildiğini gösterir. Böbrekleri topladıktan sonra, böbrek kapsüllerini çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Böbrek dokusu örneklerini OCT bileşiğine gömün ve sıvı azot içinde dondurun.
Bölümleri hazırlamak ve bölümleri silan kaplı cam slaytlara monte etmek için bir kriyostat kullanın. Bunları% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve slaytları PBS ile iki kez hafifçe yıkayın. Son olarak, floresan boyamayı floresan mikroskobu ile 100x ve 400x büyütmede ve uygun görüntüleme yazılımında görselleştirin.
Temsili görüntü, PEI-NPs-miRNA-mimik kompleksinin yapısını göstermektedir. Renal fibroziste PEI-NP'ler kullanılarak miRNA-146a-5p-mimik kullanımının verilmesi ve etkileri bu görüntülerde gösterilmiştir. Floresan mikroskopi analizi, PEI-NP'lerin kuyruk-ven enjeksiyonunun, miRNA taklitini tübülointerstisyel boşluğa iletebileceğini göstermiştir.
UUO tarafından üretilen renal fibroz farelerinde, bu, böbrek ve glomerulusta düzenli bir forma sahip olmayan renal tübüler hücreleri içeriyordu. qRT-PCR analizi, PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimik enjeksiyonunun böbrekte miRNA-146a-5p'nin önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna neden olduğunu göstermiştir. Sirius kırmızı boyama ile histolojik analiz burada gösterilmiştir.
Floresan mikroskopi analizi, PEI-NP'lerin kuyruk-ven enjeksiyonunun, diyabetik böbrek modeli farelerin böbreklerindeki glomerulus ve tübülointerstisyel boşluğa in vivo miRNA taklidi verebileceğini göstermiştir. Ek olarak, qRT-PCR analizi, PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimik enjeksiyonunun böbrekte miRNA-181b-5p'nin önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna neden olduğunu göstermiştir. Periyodik asit-Schiff boyaması ile yapılan histolojik analiz, PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimik enjeksiyonunun 10 ila 20 haftalıkken haftada bir kez farelerde diyabetik böbrek hastalığının ilerlemesini engellediğini göstermiştir.
Burada iskemi reperfüzyon hasarı ile üretilen akut böbrek hasarı model farelerde PEI-NPs-miRNA-5100-mimik verilmesi ve etkileri gösterilmiştir. Bu görüntülerde PEI-NPs-miRNA-5100-mimik enjeksiyonunu takiben miRNA-5100'ün aşırı ekspresyon etkilerini değerlendirmek için floresan mikroskopi analizi qRT-PCR analizi ve hematoksilin-eozin boyalı böbreğin histolojik analizi verileri gösterilmektedir. İskemi reperfüzyon hasarından veya IRI prosedüründen iki gün önce kuyruk damarından enjekte edilen PEI-NP'ler, IRI tarafından indüklenen akut böbrek hasarı ilerlemesini önler.
Bu tekniği uygularken, mümkün olduğunca fazla böbrek dokusu içeren beş mikrometre kalınlığında bölümler hazırlayın. Ayrıca yedi mikrometre kalınlığında bölümler de hazırlayabilirsiniz.
