이 방법은 신장에 대한 microRNA 치료의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 여전히 도전 과제로 남아 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인터페론 반응이나 유전적 불안정성을 일으키지 않고 신장에 대한 microRNA 모방 치료가 가능하다는 것입니다. 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에서 90 마이크로 리터의 5 % 포도당 용액에 10 마이크로 리터의 PEI-NP를 용해시키는 것으로 시작하십시오.
그런 다음 튜브를 부드럽게 소용돌이 치고 아래로 회전시킵니다. 100마이크로몰의 뉴클레아제가 없는 물에 용해된 인공적으로 합성된 miRNA 50마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로원심분리기 튜브에서 50마이크로몰의 10% 포도당 용액과 혼합합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이 치고 아래로 돌립니다.
이 과정은 5%포도당 용액에 용해된 miRNA를 생성합니다. 그런 다음 5 % 포도당 용액에 100 마이크로 리터의 PEI-NP를 혼합하고 5 % 포도당 용액에 100 마이크로 리터의 miRNA 모방을 혼합합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이 치고 아래로 돌립니다.
혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 PEI-NPs miRNA 모조물의 안정한 복합체를 제조하였다. 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브의 10 % 포도당 용액 98 마이크로 리터에 2 마이크로 리터의 PEI-NP를 용해시킵니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이 치고 아래로 돌립니다.
그런 다음 100 마이크로 리터의 Cy3 표지 miRNA 모방체를 10 % 포도당 용액의 100 마이크로 리터의 PEI-NP에 넣고 튜브를 부드럽게 소용돌이칩니다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 PEI-NPs-Cy3-표지된-miRNA-모방체의 안정한 복합체를 제조하였다. UUO 마우스를 마취없이 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에 먼저 넣은 다음 캡의 준비된 구멍을 통해 꼬리를 놓습니다.
1밀리리터 주사기에 30게이지 바늘에 200마이크로리터의 PEI-NPs-Cy3-표지-miRNA-모방 복합체를 채우고 마우스의 꼬리 정맥을 통해 복합체를 주입합니다. 다음으로 수술용 가위와 집게로 피부, 근육, 갈비뼈를 절개하여 심장을 노출시킵니다. 우심방을 절개한 후 신장색이 옅은 노란색으로 바뀔 때까지 PBS를 좌심실에 주입합니다.
이는 마우스 본체 전체가 PBS로 관류되어 있음을 나타낸다. 신장을 채취 한 후 신장 캡슐을 제거하고 PBS로 두 번 세척하십시오. 신장 조직 샘플을 OCT 화합물에 삽입하고 액체 질소에서 동결시킵니다.
저온 유지 장치를 사용하여 섹션을 준비하고 섹션을 실란 코팅 유리 슬라이드에 장착합니다. 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하고 PBS로 슬라이드를 두 번 부드럽게 씻습니다. 마지막으로, 형광 현미경을 100x 및 400x 배율로 시각화하고 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 형광 염색을 시각화합니다.
대표 이미지는 PEI-NPs-miRNA-mimic 복합체의 구조를 보여줍니다. 신장 섬유증에서 PEI-NP를 사용한 miRNA-146a-5p-모방체의 전달 및 효과가 이 이미지에 묘사되어 있습니다. 형광 현미경 분석은 PEI-NP의 꼬리 정맥 주입이 miRNA 모방체를 세뇨관 간질 공간에 전달할 수 있음을 보여주었습니다.
UUO에 의해 생산된 신장 섬유증 마우스에서, 이것은 신장 및 사구체에 규칙적인 형태를 갖지 않는 신장 세뇨관 세포를 포함하였다. qRT-PCR 분석은 PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic의 주입이 신장에서 miRNA-146a-5p의 현저한 과발현을 유도한다는 것을 보여주었다. 시리우스 레드 염색을 사용한 조직학적 분석이 여기에 나와 있습니다.
형광 현미경 분석은 PEI-NP의 꼬리 정맥 주사가 생체 내에서 당뇨병성 신장 모델 마우스의 신장에 있는 사구체 및 세뇨관 간질 공간에 miRNA 모방을 전달할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, qRT-PCR 분석은 PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic의 주입이 신장에서 miRNA-181b-5p의 현저한 과발현을 유도하는 것으로 나타났다. Periodic acid-Schiff 염색을 이용한 조직학적 분석은 10주령에서 20주령까지 일주일에 한 번 PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic을 주사하면 마우스에서 당뇨병성 신장 질환의 진행을 억제하는 것으로 나타났습니다.
허혈 재관류 손상에 의해 생산된 급성 신장 손상 모델 마우스에서 PEI-NPs-miRNA-5100-mimic의 전달 및 효과가 여기에 제시되어 있다. PEI-NPs-miRNA-5100-mimic 주입 후 miRNA-5100의 과발현 효과를 평가하기 위한 형광 현미경 분석 qRT-PCR 분석의 데이터와 헤마톡실린-에오신 염색 신장의 조직학적 분석이 이 이미지에 묘사되어 있습니다. 허혈 재관류 손상 또는 IRI 시술 2일 전에 꼬리 정맥을 통해 주사된 PEI-NP는 IRI에 의해 유발된 급성 신장 손상 진행을 예방합니다.
이 기술을 수행 할 때 가능한 한 많은 신장 조직을 포함하는 5 마이크로 미터 두께의 섹션을 준비하십시오. 7 마이크로 미터 두께의 섹션을 준비 할 수도 있습니다.
