Desarrollamos un nuevo método utilizando un analizador XF de caballito de mar para medir directamente la tasa de consumo de oxígeno. Pero el proxy común para la función mitocondrial en la rebanada de deslizamiento agudo de ratones adultos. Este método mide una célula por energía en punciones de estructuras cerebrales definidas anatómicamente.
El uso de rebanadas agudas imita más de cerca el entorno celular fisiológico que no se puede lograr de las formas aisladas mitocondriales o células de cultivo. Este método será de amplio interés para los investigadores que trabajan en el campo de la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington. Para comenzar, abra el kit de ensayo de flujo extracelular y retire tanto el cartucho del sensor como la placa de utilidad.
A continuación, coloque el cartucho del sensor a un lado y no toque los sensores. A continuación, agregue 600 microlitros de solución calibrada a cada pared de la placa de utilidad. Coloque el cartucho del sensor en la parte superior de la placa de utilidad y sumerja los sensores en la solución de calibración, asegurándose de que la muesca triangular de la placa del cartucho de la utilidad y del sensor estén correctamente alineadas.
Después, selle el kit de ensayo de flujo extracelular con una película de sellado para evitar la evaporación de la solución calibrada y luego colóquelo en una incubadora de 37 grados Celsius no suplementada con dióxido de carbono u oxígeno, durante la noche. Abra la microplaca de captura de ojales y saque la placa del ojal para sentar el tejido. Luego caliente un volumen apropiado de tampón de líquido cefalorraquídeo artificial modificado preoxigenado a 37 grados Celsius en un tubo de 50 mililitros.
A continuación, agregue BSA a una concentración final de cuatro miligramos por mililitro para preparar el tampón de respiración. Agregue 625 microlitros de tampón de respiración a cada pocillo de la placa del ojal con cuidado mientras evita agitar la placa, asegurándose de que no haya burbujas de aire presentes en el tampón de cada pozo. Diseccionar inmediatamente el cerebro en 10 mililitros de solución de corte preoxigenada helada.
Luego, utilizando una sección de vibratomo cortes estriatales coronales, siguiendo las instrucciones del fabricante a un espesor de 150 micrómetros en solución de corte preoxigenada helada. A continuación, recupere las rebanadas en 50 mililitros de líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado. Y manténgalos en solución hasta por 30 minutos a temperatura ambiente.
Después de la recuperación, transfiera las rodajas a una placa de Petri de 35 por 10 milímetros con cinco milímetros de tampón de respiración. Usando un punzón de biopsia de acero inoxidable, cree una pieza circular de tejido en el área deseada del cerebro cortado presionando suavemente el punzón mientras mantiene la rebanada en el tampón. Luego retire el resto del tejido, levante el punzón y retire la pieza circular de tejido en el tampón.
A continuación, corte el extremo de una punta de pipeta de un mililitro para hacer un agujero con un diámetro de un milímetro de punto cinco a dos punto cero y úselo para sostener y transferir la rebanada perforada a la parte superior de la pantalla de captura. Succione una pieza de tejido cerebral perforado y coloque cuidadosamente el tejido en el lado de malla de la pantalla de captura, una pieza circular de plástico con la malla unida a un lado. Usando un pañuelo de papel, seque suavemente la pantalla de captura y elimine la humedad, lo que permite que el tejido se vuelva pegajoso y se adhiera al centro de la malla.
A continuación, sostenga la pantalla de captura con pinzas y colóquela en uno de los pocillos de la placa del ojal de incubación. Luego incube la placa del ojal a 37 grados Celsius en una incubadora durante al menos 30 minutos para permitir el equilibrio de la temperatura y el pH antes de ejecutar el ensayo. Diluir los compuestos deseados y modificar el líquido cefalorraquídeo artificial sin BSA a la concentración final de la concentración de trabajo para los puertos A a D, respectivamente.
Precargue suavemente 75 microlitros de los compuestos diluidos en los puertos de inyección apropiados del cartucho del sensor colocando las puntas a la mitad de los puertos de inyección en un ángulo de 45 grados con la punta contra la pared del puerto de inyección, ya que la inserción completa puede causar fugas de compuestos a través del puerto. Después, retire las puntas de los puertos con cuidado sin crear burbujas de aire y no toque ninguna parte del cartucho para evitar aliviar las burbujas de aire. A continuación, inspeccione visualmente los puertos de inyección para una carga uniforme, asegurándose de que todo el líquido esté en el puerto y que no haya gotas residuales en la parte superior del cartucho.
Después de colocar el cartucho del sensor en la placa de utilidad, colóquelo en una incubadora durante 30 minutos para permitir que se caliente hasta 37 grados centígrados mientras se maneja con cuidado al sujetar solo la placa de servicio y moverse lo menos posible. Primero cargue la plantilla de ensayo en el software y luego presione el botón verde de inicio. Luego cargue el cartucho del sensor en la placa de utilidad en la bandeja de instrumentos, asegurándose de que la placa se asiente correctamente y esté plana, cargando el cartucho del sensor lleno de drogas en el analizador para su calibración.
Después, siga las instrucciones en la pantalla para calibrar. Y equilibrar los sensores. Una vez que se haya realizado el paso de equilibrio, retire la placa de calibración y reemplácela con la placa del ojal que contiene la malla y las rodajas de tejido.
Luego mida la tasa de consumo de oxígeno en cada pozo de la placa, utilizando los protocolos de ensayo como se describe en el manuscrito. A continuación, analice los datos de medición de la tasa de consumo de oxígeno y los datos de eficiencia de acoplamiento. Las tasas de consumo de oxígeno para diferentes espesores y tamaños de punzonado de rodajas en el grupo de control mostraron una respiración basal estable durante toda la medición y fueron proporcionales al volumen de la rebanada.
Además, las tasas de consumo de oxígeno fueron relativamente estables durante cinco horas con menos del 10% de agotamiento. Se comparó la eficiencia de acoplamiento mitocondrial y la rebanada con un grosor de 150 micrómetros y un tamaño de punzón de 1,5 milímetros mostró la mayor eficiencia de acoplamiento. Las tasas de consumo de oxígeno se midieron para los grupos jóvenes y viejos de Pink1 knockout y sus ratones de tipo salvaje de la misma edad.
La tasa de consumo de oxígeno basal fue similar tanto en los grupos knockout como en los de tipo salvaje para ratones jóvenes. Sin embargo, disminuyó para los ratones knockout en el grupo antiguo. Sin embargo, la disfunción mitocondrial en los ratones knockout se observó para el grupo de edad joven, indicada por la disminución de la eficiencia de acoplamiento causada por el knockout de Pink1.
Los pasos críticos en este protocolo incluyen preparar cortes de cerebro, transferirlos a la parte superior de la pantalla de captura, colocar diapositivas en pozos y mantenerlos unidos a la pantalla de captura durante las mediciones.
