Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del metabolismo, tales como, cómo se altera la actividad metabólica durante el proceso de envejecimiento. La principal ventaja de esta técnica es el uso de un segmento corporal intacto que tiene datos que se asemejan mucho al estado natural y fisiológico en comparación con el aislamiento mitocondrial clásico. Demostrar el procedimiento serán Anuroop y Annika, estudiantes de posgrado en mi laboratorio.
Para comenzar el protocolo, encienda la máquina una hora antes de iniciar el experimento para que haya tiempo suficiente para alcanzar la temperatura deseada y permanecer estable. A continuación, en la configuración del software, en modo de administración, elija la longitud de la calibración del cartucho y la temperatura deseada. A continuación, introduzca el siguiente protocolo:Dependiendo del diseño experimental, agregue los pasos de inyección de los puertos A a D después de un paso de medición elegido.
Para comprobar la calidad y la determinación del OCR basal, ajuste el protocolo durante al menos tres ciclos de medición antes de establecer la inyección del primer medicamento a través del puerto A.Precalibrar el cartucho un día, o al menos cuatro horas antes de la prueba, añadiendo 1,0 mililitros de calibrador a cada pozo, y coloque el cartucho del sensor en la parte superior de la placa. Cubra el cartucho con Parafilm si está programado para hidratarse durante más de 24 horas para evitar la evaporación. Almacene el cartucho a 37 grados centígrados sin CO2 durante la noche.
A continuación, asegúrese de que los fármacos experimentales se disuelven a fondo en medio fresco, más 2,5% de glucosa. Mida y ajuste el pH de la solución del medicamento al pH del vehículo a la temperatura deseada. Pipetear la solución de drogas en su puerto de inyección asignado.
A continuación, cargue el cartucho en la máquina e inicie la calibración. Ajuste los medios recién preparados más 2,5% de glucosa al pH deseado con un HCl normal. A continuación, prepare una caja de hielo y coloque una placa de metal sobre el hielo.
Abra el paquete de placas de ojales. Sumerja las redes en medios por un plato Petri de 16 milímetros. Recoger una red con el insertador y hacer que el insertador se ponga de pie junto al microscopio.
Agregue una pequeña gota de soporte a la red conectada al insertador. Luego, anestesia a las moscas colocándolas en una placa de metal helada. Usando fórceps, agarra el abdomen de una mosca y sumérgelo en los medios en una placa Petri bajo el microscopio.
Con un segundo par de fórceps, retire suavemente la cabeza de la mosca. Coloque la cabeza en el centro de la red unida al insertador y compruebe que la cabeza esté sumergida en medios. Retire el líquido superfluo antes de centrar las cabezas para evitar la pérdida de cabezas mientras las coloca en el pozo.
Cuando haya 16 cabezas en la red, concéntrelos. Usando el insertador, coloque la red en el pozo. Asegúrese de que las cabezas estén atrapadas bajo la red y agregue lentamente 700 microlitros de medios más 2,5% de glucosa.
Asegúrese de que los pozos vacíos, que se utilizan para el fondo, también contienen una red con 700 microlitros del tampón más 2,5% de glucosa. Compruebe los pozos en busca de burbujas de aire debajo de las redes a través del microscopio. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta de un milímetro para eliminar cualquier burbuja.
Mantenga los cabezales centrados para una lectura confiable del OCR. A continuación, añada la placa a la máquina e inicie la medición. Al final del protocolo, retire el cartucho.
Confirme visualmente que no hay sobras visibles en los rellenos de puertos. A continuación, deseche el cartucho y la placa si las cabezas no se van a utilizar para la extracción de proteínas. Recuerde mirar los niveles de oxígeno y pH, con el fin de detectar cualquier pozo anormal antes del análisis.
Además, es importante elegir el cálculo adecuado de la tasa de consumo de oxígeno, basado en los niveles de oxígeno. Al realizar el protocolo, se observó que los niveles de oxígeno de las cabezas de mediana edad cayeron más rápido que los cabezas de mosca jóvenes. Cuando el rango de los niveles de oxígeno es similar entre las condiciones, es mejor utilizar el algoritmo AKOS para generar automáticamente la tasa de consumo de oxígeno, u OCR, que refleja de forma fiable los cambios de nivel de oxígeno durante una medición entre cabezas jóvenes frente a medias.
La adición de butirato de sodio, o SB, un inhibidor de KDAC, cambia transitoriamente la dinámica de los niveles de oxígeno. Mientras que los controles del vehículo muestran niveles constantes de oxígeno durante la primera y la última garrapata, la adición SB causa una caída considerable y transitoria de los niveles de oxígeno en estas garrapatas. Debido a que el cálculo de AKOS considera todos los ticks e ignora un estado anóxico, genera un OCR engañoso, como se observa en los niveles de OCR no normalizados basados en AKOS, que muestran pocos cambios en la inyección del puerto A.El algoritmo fijo, que modela más estrechamente y se asemeja a los cambios de nivel de OCR y oxígeno, revela un aumento de OCR en el tratamiento SB.
Al intentar este procedimiento, es importante trabajar con dos personas juntas para asegurar una cantidad relativamente corta de tiempo para preparar una sola placa. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos bioquímicos, como Western Blot y espectrometría de masas para responder preguntas relacionadas con mecanismos moleculares, por ejemplo, aquellos que moderan las alteraciones metabólicas.
