Este protocolo se puede utilizar para producir películas de lapso de tiempo de Pseudomonas aeruginosa enjambre y para capturar la repulsión de enjambre por bacteriófagos o antibióticos. Las películas de lapso de tiempo capturan la dinámica detallada de la respuesta enjambre a los antibióticos y los bacteriófagos y la técnica solo requiere un deshumidificador, computadora, incubadora y escáner de documentos. Para preparar placas de agar enjambre para imágenes de lapso de tiempo enjambre de P.aeruginosa, utilice una pipeta de 25 mililitros para agregar 20 mililitros de solución de agar enjambre a cada plato experimental de Petri de 10 centímetros de diámetro.
Coloque las placas en una sola pila con tapas durante una hora a temperatura ambiente. Encienda un deshumidificador para disminuir la humedad relativa de la habitación a 40-50%Cuando el agar se haya solidificado, seque las placas de agar enjambre durante 30 minutos adicionales en una capucha de flujo laminar con las tapas apagadas y boca arriba a 300 pies cúbicos por minuto con una humedad relativa del 40-50% a temperatura ambiente. A continuación, guarde las placas de agar enjambre secas a cuatro grados centígrados durante un máximo de 24 horas.
Para enjambre de agar, sostenga una punta de pipeta P20 cargada con cinco microlitros de un cultivo de P.aeruginosa durante la noche en un ángulo de 10-45 grados 2-1/2 centímetros por encima del centro de una placa enjambre y presione el émbolo hasta el primer punto de tocar el agar con sólo la gota de líquido. Utilice una plantilla para colocar el punto de forma consistente en las diferentes placas de agar enjambre. Para placar una infección de fago, primero mezcle 30 microlitros de P.aeruginosa cultivada durante la noche con seis microlitros de una por 10 a las 12 unidades formadoras de placas por mililitro de fago DMS3 vir e inmediatamente agregue seis microlitros de la mezcla de faje P.aeruginosa en seis posiciones de satélite equidistantes en un círculo concéntrico de radio de 2,8 centímetros como se demuestra.
Utilice una plantilla para colocar el punto de forma consistente en diferentes placas de agar enjambre. Para plato de tratamientos antibiótico, mezclar 30 microlitros de P.aeruginosa cultivado durante la noche con la concentración y el volumen apropiados del antibiótico de interés e inmediatamente añadir seis microlitros de las bacterias tratadas con antibióticos en seis posiciones de satélite equidistantes en un círculo concéntrico de radio de 2,8 centímetros sobre el centro de la placa. Utilice una plantilla para colocar el punto de forma consistente en las diferentes placas de agar enjambre.
Cuando todos los cultivos hayan sido chapados, sustituya las tapas transparentes del plato Petri por tapas negras hechas a medida. Coloque cuidadosamente las placas de agar enjambre en un escáner en una incubadora situada en 37 grados Celsius con un baño de agua de 10 litros para mantener la humedad en 75%Después de colocar las placas en el escáner, abra el archivo y guarde los ajustes para establecer la ruta de guardado para las imágenes y haga clic en escanear y OK a intervalos de 30 minutos. Para automatizar la adquisición de imágenes, utilice el software de scripting.
Seleccione el análisis inactivo y el análisis único y haga clic con el botón derecho en el análisis inactivo y, a continuación, haga clic con el botón izquierdo del 200 al 200 al 200 del hotel. Al final de la incubación, importe todas las imágenes escaneadas en ImageJ. En la ventana de opciones de secuencia, el número de imágenes indicará el número de imágenes seleccionadas.
Siga iniciando la imagen en una para comenzar desde la primera imagen de la carpeta y las imágenes de escala al 100% para conservar el tamaño original de las imágenes. Haga clic en encubierto a RGB para mantener las imágenes en color. Deje la opción Usar pila virtual desactivada y haga clic en Aceptar para cargar las imágenes.
Haga clic en archivo, guardar como y AVI para fusionar las imágenes en un archivo AVI. Ajuste la compresión a JPEG y la velocidad de fotogramas a cinco fotogramas por segundo. A continuación, guarde el lapso de tiempo AVI en la carpeta de almacenamiento adecuada.
Las imágenes de lapso de tiempo de una sola colonia de P.aeruginosa de tipo salvaje a partir de una placa de agar LB en caldo LB durante la noche a 37 grados centígrados y manchadas en el centro de una placa de agar enjambre revela un crecimiento inicial en forma de colonia en el centro de la placa que se extiende en los zarcillos radialmente desde la colonia. Los enjambres se mueven desde el centro de las placas de agar enjambre a la periferia y son repelidos por una señal de estrés emitida por las bacterias que fueron infectadas con fagos o tratadas con Gentamicina. Los fagos o gentamicina detectados solos en las posiciones de los satélites no hacen que las poblaciones enjambres eviten estas áreas.
Utilice una pipeta de 25 mililitros para asegurarse de que las placas de agar enjambre contienen exactamente 20 mililitros. También es importante ajustar el tiempo de secado de la placa de acuerdo con el entorno de laboratorio. Nuestra técnica nos permite visualizar los patrones generales de enjambre de las poblaciones de Pseudomonas aeruginosa.
El siguiente objetivo es monitorear la motilidad celular individual usando la microscopía Brightfield.
