O protocolo rastreia simultaneamente respostas bacterianas a diferentes concentrações de indutores em um ágar semisólida. Isso é conseguido de forma econômica. Esta técnica de triagem de alto rendimento nega a necessidade de ágar com várias concentrações indutoras para observar as respostas microquimotacticas.
A técnica foi projetada para triagem de medicamentos e também para observar as respostas do Micropatagen SD. Além disso, pode ser usado para estudar microresponsos a várias pistas bioquímicas no hospedeiro humano. Este método pode fornecer informações sobre quimiotaxis bacterianos.
As bactérias responderão a várias concentrações de atrativos químicos conhecidos como quimitaxis positivos ou repelentes químicos conhecidos como quimiotaxis negativos. Uma configuração cuidadosamente preparada é essencial para evitar variações entre o ângulo de gel da camada inferior para evitar o problema de reprodubilidade. Para começar, rotule 13 por 13 centímetros quadrados de placas de Petri com manchas e nomes de indutores.
Em seguida, apoie os pratos sobre a borda das tampas. Adicione a solução arabinose ao meio de camada inferior quente. Adicione 40 mililitros de meio de camada inferior quente.
Deixe que o meio de camada inferior cure descoberto por uma hora dentro de um capô de fluxo laminar sem ser perturbado. Uma vez que a camada inferior esteja completamente solidificada, remova as tampas e coloque as placas de Petri dentro de um capô de fluxo laminar. Adicione 40 mililitros de meio de camada superior quente usando um filtro de pipeta motorizado.
Cure as placas de camada dupla cobertas e imperturbáveis por uma hora, depois armazene-as a quatro graus Celsius por 24 horas. Coloque o papel A4 marcado sob uma placa de gradiente bem solidificada. Empurre o lado mais amplo de uma ponta de pipeta de 100 microliter para dentro da superfície média semisóida na posição marcada e pressione a ponta da pipeta até atingir a parte inferior do meio da camada superior.
Quando a ponta tocar na parte inferior, pare de aplicar qualquer força vertical na ponta e gire suavemente a ponta para isolar o conteúdo do poço cilíndrico. Mova horizontalmente a ponta da pipeta a uma pequena distância para permitir o fluxo de ar para o lugar estreito reservado. Pressione a ponta com o dedo indicador para bloquear o fluxo de gás dentro da ponta.
Puxe a ponta verticalmente, mantendo o bem conteúdo na ponta enquanto puxa-o para fora. Adicione 80 microliters da cultura de crescimento da noite para o dia em todos os poços. Tire as placas de enxame da incubadora uma de cada vez a cada 12 horas e coloque-as no sistema de imagem em gel.
Selecione o modo de imagem em gel, exponha a placa do enxame à luz branca e ajuste a distância focal para obter uma visão clara dos enxames. Aumente o brilho dos enxames para observação precisa, ajustando o tempo de exposição a 300 milissegundos. Ajuste o limiar para minimizar a interferência da luz de fundo.
Salve o arquivo de imagem para análise suplementar. Registo o tempo de imagem, o tipo de indutor, a orientação gradiente e as cepas em um arquivo txt. Clique em Process, em seguida, Sombras para melhorar a nitidez da imagem.
Clique em Processo seguido de Batch para processar a imagem. Em seguida, processe uma imagem como referência clicando em Process, Shadows e South. Clique em Processar, Lote, Macro para abrir a janela Processo de lote.
Procure os comandos exibidos na janela. Digite o endereço da pasta das imagens originais no endereço do arquivo de saída clicando em Processar na janela Processo de lote. Use a ferramenta de rastreamento de varinha para selecionar enxames individualmente e clique duas vezes na ferramenta de rastreamento de varinha para ajustar a tolerância até que a linha gerada se encaixe corretamente no limite do enxame.
Clique em Analisar e, em seguida, Meça para exportar o valor da área. E.coli K12 YdeH foi testado em placas de gradiente arabinose usadas para demonstrar o processo de enxame de superfície com sobreposição ocorrendo entre poços adjacentes. Uma placa com três poços de teste permitiu a formação de limites não sobrepostos.
P.aeruginosa PAO1 YdeH foi promovida com maior concentração arabinosa a partir da menor concentração, mas gradualmente restrita com maiores concentrações arabinosas. As cepas de tipo selvagem E.coli K12 testadas em placas gradientes de resveratrol dentro da faixa de concentração de microliter de zero a 400 microlitera mostraram uma restrição modesta da motilidade de enxame com crescente concentração de resveratrol. As áreas de enxame foram quantificadas pelo software ImageJ.
A curva de enxame exibiu as múltiplas respostas de concentração. A parte mais crucial deste procedimento é a fabricação de uma placa de enxame de camada dupla com uma faixa de concentração específica de indutores. Este método permite que os pesquisadores investiguem a superfície induzida dentro de uma faixa de concentração específica e quantifiquem os efeitos de outros indutores e componentes no enxame.
