이 프로토콜은 반고체 한천에서 다른 유도제 농도에 대한 박테리아 떼 반응을 동시에 추적합니다. 이것은 비용 효율적인 방식으로 달성됩니다. 이 높은 처리량 스크리닝 기술은 미세 화학 요법 반응을 관찰하기 위해 다양한 유도제 농도의 한천의 필요성을 무효화합니다.
이 기술은 약물 스크리닝 및 미세 병원체 SD 반응을 관찰하기 위해 설계되었습니다. 또한, 인간 숙주에서 다양한 생화학적 단서에 대한 미세반응을 연구하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 박테리아 화학주성에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
박테리아는 양성 화학주성 또는 음성 화학주성으로 알려진 화학적 기피제로 알려진 화학적 유인제의 다양한 농도에 반응할 것이다. 재현성 문제를 방지하기 위해 하층의 젤 각도 간의 변화를 피하기 위해 신중하게 준비된 설정이 필수적입니다. 시작하려면 얼룩과 유도기 이름으로 13 x 13 센티미터 정사각형 페트리 요리에 라벨을 붙입니다.
그런 다음 뚜껑 가장자리 위에 접시를 올려 놓습니다. 아라비노스 용액을 따뜻한 바닥층 매체에 첨가하십시오. 40 밀리리터의 따뜻한 바닥 층 매체를 넣으십시오.
바닥층 매체가 층류 후드 내부에서 한 시간 동안 뚜껑을 덮지 않고 경화되도록 하십시오. 바닥층이 완전히 굳어지면 뚜껑을 제거하고 페트리 접시를 층류 후드 안에 놓습니다. 전동 피펫 필터를 사용하여 40 밀리리터의 따뜻한 상층 매체를 추가하십시오.
덮고 한 시간 동안 방해받지 않는 이중층 플레이트를 치료 한 다음 섭씨 4도에서 24 시간 동안 보관하십시오. 표시된 A4 용지를 잘 응고된 그라디언트 플레이트 아래에 놓습니다. 100 마이크로리터 피펫 팁의 더 넓은 면을 표시된 위치의 반고체 매체 표면에 밀어 넣고 피펫 팁이 상층 매체의 바닥에 도달할 때까지 누릅니다.
팁이 바닥에 닿으면 팁에 수직 힘을 가하는 것을 멈추고 팁을 부드럽게 돌려 원통형 웰의 함량을 분리하십시오. 피펫 팁을 작은 거리를 따라 수평으로 움직여 공기가 옆으로 떨어진 좁은 곳으로 흐르도록하십시오. 집게 손가락으로 팁을 눌러 팁 내부의 가스 흐름을 차단합니다.
팁을 세로로 당겨 팁의 내용물을 유지하면서도 밖으로 당깁니다. 80 마이크로 리터의 하룻밤 성장 배양물을 모든 웰에 첨가하십시오. 떼 접시를 인큐베이터에서 12 시간마다 한 번에 하나씩 꺼내어 젤 이미징 시스템에 놓습니다.
젤 이미징 모드를 선택하고, 떼 플레이트를 백색광에 노출시키고, 초점 거리를 조정하여 떼를 선명하게 볼 수 있습니다. 노출 시간을 300밀리초로 조정하여 정확한 관찰을 위해 떼의 밝기를 향상시킵니다. 임계값을 조정하여 배경광으로부터의 간섭을 최소화합니다.
추가 분석을 위해 이미지 파일을 저장합니다. 이미징 시간, 유도기 유형, 그라디언트 방향 및 변형을 txt 파일에 기록합니다. [프로세스]를 클릭한 다음 [그림자]를 클릭하여 이미지의 선명도를 높입니다.
프로세스를 클릭 한 다음 배치를 클릭하여 이미지를 처리합니다. 그런 다음 프로세스, 그림자 및 남쪽을 클릭하여 이미지를 참조로 처리합니다. 프로세스, 배치, 매크로를 클릭하여 배치 프로세스 창을 엽니다.
창에 표시된 명령을 찾습니다. 배치 프로세스 창에서 프로세스를 클릭하여 출력 파일 주소에 원본 이미지의 폴더 주소를 입력합니다. 지팡이 추적 도구를 사용하여 떼를 개별적으로 선택하고 지팡이 추적 도구를 두 번 클릭하여 생성 된 선이 떼 경계에 올바르게 맞을 때까지 공차를 조정하십시오.
분석을 클릭한 다음 측정을 클릭하여 영역 값을 내보냅니다. E.coli K12 YdeH는 인접한 웰들 사이에서 발생하는 중첩을 갖는 표면 떼 떼 과정을 입증하기 위해 사용된 아라비노스 구배 플레이트에서 시험되었다. 세 개의 테스트 웰이 있는 플레이트는 겹치지 않는 경계의 형성을 가능하게 했습니다.
P.aeruginosa PAO1 YdeH 떼 운동성은 최저 농도에서 아라비노스 농도가 증가하면서 촉진되었지만 더 높은 농도의 아라비노스 농도로 점차 제한되었습니다. 0 내지 400 마이크로리터 농도 범위 내의 레스베라트롤 구배 플레이트에서 시험된 E.coli K12 야생형 균주는 레스베라트롤 농도 증가와 함께 떼지어 운동성의 겸손한 제한을 나타냈다. 떼 영역은 ImageJ 소프트웨어에 의해 정량화되었습니다.
떼 지어 오는 곡선은 여러 농도 반응을 표시했습니다. 이 절차의 가장 중요한 부분은 유도제의 특정 농도 범위를 가진 이중층 떼 플레이트를 제조하는 것입니다. 이 방법을 통해 연구자들은 특정 농도 범위 내에서 유도 된 표면 떼를 조사하고 다른 유도제 및 구성 요소가 떼지어 오는 것에 미치는 영향을 정량화 할 수 있습니다.
