Este protocolo destaca los pasos clave para amplificar, diferenciar y criopreservar las células epiteliales nasales primarias. En nuestras condiciones de cultivo, las células epiteliales nasales primarias imitan el epitelio pulmonar. Esto permite cultivos derivados de pacientes y estudios de medicina personalizada a partir de células frescas o biobancarias.
Los cultivos epiteliales nasales derivados del paciente se pueden utilizar para evaluar la actividad de CFTR y ayudar con la terapia de fibrosis quística mediante la evaluación de la respuesta individual del paciente a las nuevas terapias. Demostrando el procedimiento estará Aurelie Hatton, una ingeniera de mi laboratorio. Para empezar, cultivar células epiteliales nasales o HNE, en 10 mililitros de medio de amplificación.
Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en un matraz recubierto de colágeno de 75 centímetros cuadrados hasta que alcance una confluencia del 80 al 90%. Cambie el medio cada 48 a 72 horas. Más tarde, lave las células con 10 mililitros de DPBS libre de magnesio y calcio.
Aspirar y desechar la solución salina. Antes de añadir dos mililitros de tripsina al 0,25% y devolver el matraz a la incubadora durante ocho a 12 minutos. Más tarde, golpee el matraz firmemente con una palma para ayudar al desprendimiento celular.
Agregue 10 mililitros del medio de amplificación para detener la reacción enzimática. Enjuague vigorosamente el matraz con una pipeta de 10 mililitros para extraer y expulsar el medio de amplificación sobre la superficie del matraz para enjuagar y separar las células y recoger las células en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante.
Vuelva a suspender el pellet en cinco a 10 mililitros de medio de amplificación. Luego cuente las células en un hemocitómetro. Después del recuento celular, centrífuga las células a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y deseche el sobrenadante.
Luego vuelva a suspender el pellet en el medio de congelación enriquecido para obtener de tres a cinco veces 10 a las seis células por mililitro y colóquelo en un vial criogénico. Congele lentamente las células reduciendo la temperatura en aproximadamente un grado Celsius por minuto en un recipiente criocongelante apropiado a menos 80 grados Celsius. Al día siguiente, mueva la muestra conservada a un contenedor de almacenamiento de nitrógeno para su almacenamiento a largo plazo.
Caliente el medio de amplificación recién preparado en un baño de agua a 37 grados centígrados. Retire los viales criogénicos del tanque de almacenamiento de nitrógeno y colóquelos rápidamente en el baño de agua, teniendo cuidado de no sumergir todo el vial en agua. Retire los viales criogénicos del baño de agua cuando solo quede una pequeña gota congelada.
Limpie los viales con alcohol al 70% y colóquelos debajo del capó. Usando una pipeta de un mililitro, transfiera las células descongeladas a un tubo de 15 mililitros. Luego agregue un mililitro de medio de amplificación caliente de una manera superficial.
Después de un minuto, agregue otro mililitro de medio de amplificación y espere un minuto. Agregue 10 mililitros de medio de amplificación y centrífuga a 500 veces G durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar y desechar el sobrenadante.
Vuelva a suspender el pellet en un volumen de medio de amplificación necesario para lograr una densidad celular de una vez 10 a las seis celdas por mililitro. Después de sembrar las células en un matraz recubierto de colágeno de 25 centímetros cuadrados, que contiene un medio de amplificación, incuba las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Observe visualmente la expansión celular durante dos o tres días antes de realizar la amplificación celular como se demostró anteriormente.
Sembrar las células a una densidad de 3,3 veces 10 a la quinta célula por filtro en filtros porosos recubiertos de colágeno de 0,33 centímetros cuadrados, complementados con 300 microlitros de medio de amplificación en el lado apical y 900 microlitros de medio líquido de aire en el lado basolateral. Después de tres días, aspire el medio apical y cultive las células en la interfaz aire-líquido durante tres a cuatro semanas en el medio aire-líquido para establecer un epitelio diferenciado. Cambie el medio basal cada 48 a 72 horas.
Las células HNE frescas cultivadas en la interfaz aire-líquido mostraron características típicas del epitelio respiratorio polarizado y diferenciado. En las 78 muestras de células HNE, se compararon las tasas de éxito en el cepillado nasal sembrado inmediatamente y después de uno a siete días de transporte en un medio de lavado. El porcentaje medio inicial de cultivos exitosos fue del 82% y alcanzó el 87% en muestras sembradas entre cero y cinco días.
El 83% de las muestras que se diferenciaron con éxito en condiciones frescas también tuvieron éxito en muestras criopreservadas. Del mismo modo, en muestras que no lograron diferenciarse en condiciones frescas, el 71% tampoco tuvo éxito en condiciones de congelación-descongelación. Además, el 50% de las muestras congeladas entre dos y tres veces 10 a las seis células por crio vial no crecieron cuando se descongelaron, alcanzando el 80% por debajo de dos veces 10 a las seis células.
Para el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta a la forskolina y el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta al inhibidor de CFTR 172 en células HNE tratadas con DMSO, no se observaron diferencias significativas entre HNE descongelada fresca o congelada. Tras el tratamiento, ambos tipos de células mostraron una corrección significativa con un aumento en el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta a la forskolina y una disminución en el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta al inhibidor de CFTR 172. la respuesta correctiva de las terapias duales de función CFTR se evaluó en comparación con el cambio de corriente de cortocircuito de las células HNE tratadas con DMSO en respuesta a la forskolina y en respuesta al inhibidor de CFTR 172 mejoraron significativamente tanto por VX-809 más VX-770 como por VX-661 más VX-770.
Se compararon tres terapias moduladoras de CFTR diferentes en HNE de seis pacientes homocigotos con F508del. Cuando se usa en combinación con un corrector y potenciador CFTR, tanto el vértice como un modulador CFTR, corrigen el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta a la forskolina y el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta al inhibidor de CFTR 172 en una medida similar. Al congelar las células HNE, es importante tener al menos 3 millones de células por crio vial para aumentar las posibilidades de un buen resultado al descongelarse.
Se ha demostrado que la actividad de CFTR en células HNE es un buen modelo predictivo para evaluar y ajustar las terapias personalizadas en la fibrosis quística.
