La terapia individualizada para pacientes con fibrosis quística se puede lograr mediante un modelo de enfermedad in vitro para comprender la actividad de CFTR al inicio del estudio. Los organoides epiteliales nasales humanos, o organoides HNE, producen lúmenes de diferentes tamaños que se correlacionan con la actividad CFTR, distinguiendo entre organoides CF y no CF. Aquí, hemos descrito una metodología para cultivar e imágenes de estos organoides HNE en detalle.
El transporte disfuncional de iones epiteliales, particularmente el de cloruro y bicarbonato, resulta en una disminución del volumen de los fluidos de revestimiento epitelial. Esto también afecta las secreciones de moco que conducen a la mucostasis y la obstrucción. Por lo tanto, nuestro modelo HNE ha sido desarrollado para diversas aplicaciones, dependiendo del diseño experimental y los recursos del investigador.
Además de evaluar la actividad de CFTR al inicio o en respuesta a la terapéutica, esta técnica también se puede aplicar a otras enfermedades que involucran la función de las células epiteliales, especialmente el transporte de líquido celular epitelial. Estos métodos se desarrollaron principalmente para su uso en estudios de fibrosis quística. Otros estudios que evalúan los epitelios de las vías respiratorias, como la discinesia ciliar primaria, también pueden encontrar útiles estos métodos.
Estas técnicas requieren atención al detalle y precisión. También requieren una observación cuidadosa para garantizar que la expansión inicial de las células sea apropiada. Monitoree todas las culturas todos los días, y el éxito será más probable.
Para comenzar, disocie la biopsia del cepillo nasal en 8 miligramos de medios RPMI en un tubo cónico de 15 mililitros pasando el cepillo de citología varias veces a través de una punta de pipeta de gran diámetro de un mililitro. Centrifugar las células a 500 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y luego vuelva a suspender el gránulo celular en tres mililitros de solución de desprendimiento celular.
Incubar a temperatura ambiente durante 16 minutos para digerir. Use cinco mililitros del medio de expansión para lavar las células dos veces. Luego, agréguelos a un matraz T75, presiembrado con fibroblastos 3T3 irradiados, inactivados y de 50 a 60% confluentes.
Permita que las células coculten y se expandan en el medio de expansión durante 7 a 14 días. Si se introdujeron antibióticos para las células derivadas de pacientes con fibrosis quística, los medios deben reemplazarse con medios de expansión libres de antibióticos después de los tres días iniciales de cultivo, y pueden continuar cambiando los medios cada dos días hasta que el 80% se confluyen. Lave las células con 1x DPBS.
Luego, agregue 1.5 mililitros de tripsina-EDTA al 0.05% en el matraz T75 e incube durante cuatro minutos a 37 grados Celsius para eliminar el fibroblasto 3T3 irradiado e inactivado del cultivo. Enjuague el matraz T75 con 1x DPBS dos veces para lavar bien los fibroblastos 3T3 restantes. Agregue 1.5 mililitros de tripsina-EDTA al 0.05% en el matraz T75 e incube durante 10 minutos a 37 grados Celsius para separar los HNE.
Neutralice la tripsina con el inhibidor de tripsina de soja en una proporción de uno a uno. Centrifugar las células a 500 veces gi durante cinco minutos. Luego, deseche el sobrenadante y lave las células con cinco mililitros de medios de expansión una vez.
Las células ahora están listas para la siembra para cultivar organoides. Descongelar la matriz extracelular de cultivo de organoides o ECM durante la noche a cuatro grados centígrados. Enfríe los portaobjetos de angiogénesis de 15 pocillos durante la noche a la misma temperatura.
A continuación, enfríe las puntas de la pipeta a cuatro grados centígrados. Cubra los portaobjetos con cinco microlitros de frío 100% ECM sobre hielo. Colóquelos en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados durante al menos 30 minutos para su consolidación.
Contar las HNE cosechadas del cocultivo utilizando un hemocitómetro. Luego, diluya las células a 500 células por microlitros en número total, con un 20% de ECM diluido por medios de diferenciación en hielo. Saque los portaobjetos recubiertos de ECM de la incubadora y siembre cinco microlitros de la mezcla de ECM de células frías en cada uno de los pozos.
Transfiera los portaobjetos inmediatamente a una incubadora de cultivo a 37 grados Celsius durante una hora para consolidar la mezcla de ECM celular. Después de eso, saque las diapositivas de la incubadora y alimente las células en cada pozo de las diapositivas de angiogénesis de 15 pocillos con 50 microlitros de los medios de diferenciación. Devuelva el tobogán a la incubadora de cultivos a 37 grados centígrados, cambiando los medios cada dos días hasta que los organoides estén listos para más experimentos.
Pretrate las diapositivas de la cámara con fondo de vidrio de 8 pocillos con adhesivo celular durante 30 minutos. Deseche la solución y seque al aire los pocillos durante otros 30 minutos. A continuación, deseche los medios de la parte superior del ECM y luego agregue 50 microlitros del 1x PBS frío en cada pozo de los toboganes de 15 pocillos en hielo.
Pipete hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces usando 200 microlitros de la punta de pipeta de gran diámetro. Dispense la solución en el centro de un pozo de los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos. Retire el exceso de líquido inmediatamente de los pocillos con una pipeta de punta fina.
Luego, coloque el deslizamiento de la cámara en una incubadora de 37 grados Celsius durante 40 minutos para mejorar el organoide que se adhiere al fondo de vidrio. Después de 40 minutos, lave suavemente los organoides con 1x PBS dos veces y fíjelos con 300 microlitros de paraformaldehído al 4% en cada pozo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave dos veces con 1x PBS y almacene los organoides en 1x PBS establecido a cuatro grados Celsius para inmunotinción durante un máximo de dos semanas.
Para cosechar los organoides para estudios histológicos, retire los medios del cultivo y agregue 50 microlitros de frío un 1x PBS en cada pozo de los portaobjetos en hielo. Pipete hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces usando una punta de pipeta de gran diámetro de 200 microlitros. Combine todas las soluciones de los insertos de deslizamiento o cultivo de 15 pocillos en un tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo.
Ajuste el volumen total de solución en el tubo a 10 mililitros agregando 1x PBS frío. Centrifuga el tubo a cuatro grados centígrados, 300 veces g durante cinco minutos. Luego, aspire el sobrenadante y agregue 60 microlitros de histótico caliente para mezclar con el gránulo organoide usando una punta de pipeta de gran diámetro de 200 microlitros.
Transfiera la suspensión inmediatamente a un molde histológico. Después de consolidar el histogel a temperatura ambiente, coloque el bloque de molde en paraformaldehído al 4% para su fijación durante la noche a cuatro grados centígrados. Abra el software y haga clic derecho en la parte inferior de la pantalla.
A continuación, seleccione Controles de análisis, seguido de Resultados de medición automatizada. Abra la imagen organoide y seleccione de 5 a 10 organoides con lúmenes visibles. Mantenga presionado el botón derecho del ratón en la imagen para abrir el menú y seleccione ROI poligonal para delinear el organoide completo y obtener el área de superficie total del organoide.
Luego, delinea el lumen para obtener el área de lumen. Repita esto para los organoides restantes en el pozo y todos los pozos en el ensayo. Finalmente, exporte los datos a Excel.
Divida el área de lúmenes por el área de superficie total y promedie todos los organoides de la muestra para obtener la relación de lúmenes de referencia. Las imágenes de campo brillante representan HNE de una colección de muestras exitosa y no exitosa. Las HNE crecen bien en un gran grupo.
En contraste, los HNE crecen mal en dos pequeños grupos que rodean las células 3T3 irradiadas. Los organoides en la diapositiva de 15 pocillos tienen imágenes más precisas y nítidas que las del inserto de cultivo. Además de esto, no se observaron diferencias morfológicas significativas en estos dos métodos de cultivo.
Los organoides sin FQ suelen tener una luz más grande y más líquido que los organoides de FQ. La tinción de HNE en organoides de un sujeto sin FQ, F508del/F508del, y la tinción inmunofluorescente de cilios en un organoide se muestran en estas imágenes. Los cilios teñidos con acetilado-tubulina, el anticuerpo secundario marcado con FITC y los núcleos marcados con DAPI se muestran aquí.
Aquí se muestran imágenes de máxima proyección de los dos organoides representativos por tinción inmunofluorescente de montaje completo y sus correspondientes imágenes de reconstrucción tridimensional. Se muestran moco y cilios dentro de la luz de los organoides. Las imágenes gráficas representan el ensayo de hinchazón inducido por forskolina para probar la función CFTR en las células epiteliales nasales primarias.
Aquí se muestra un experimento representativo de dosis-respuesta de forskolina de voluntarios sin FQ. La dosis-respuesta de FSK se compara con el cambio fraccional promedio a una hora, versus a las ocho horas, lo que sugiere que el ensayo de ocho horas puede producir una diferencia de hinchazón más significativa entre las diferentes dosis de FSK que las de una hora. El área debajo de la curva puede mostrar una diferencia menor en la hinchazón en comparación con el cambio fraccional promedio a las ocho horas.
Al intentar este procedimiento, tenga en cuenta que los organoides se perderán durante el proceso de recolección, fijación y tinción. Por lo tanto, se debe tener un cuidado meticuloso durante cada paso y se deben obtener suficientes números iniciales para garantizar el éxito. El cultivo de organoides en insertos de cultivo puede ayudar en este sentido, ya que se desarrollan estas técnicas.
Aquí, hemos utilizado reactivos y suministros disponibles comercialmente para facilitar la expansión a otros investigadores. También se desarrolló un ensayo funcional que utilizó técnicas comunes de microscopio y equipos más especializados.
