El objetivo de este método es identificar mutantes en la vía fotorrespiratoria mediante un cribado bajo en CO2. Presentamos un método para identificar mutantes que están interrumpiendo la fotorrespiración después de la exposición a bajo CO2. Una ventaja de este método es que es un cribado de alto rendimiento para plántulas que se puede hacer en un período de tiempo relativamente corto.
Las siguientes secciones proporcionarán detalles sobre la preparación y esterilización de semillas, el crecimiento de las plantas y el tratamiento con bajo contenido de CO2, configurarán el sistema de imágenes de fluorescencia, medirán el rendimiento cuántico de las muestras tratadas, resultados representativos y conclusiones. Preparación y esterilización de semillas. La preparación de semillas consiste en la ingesta de semillas y la esterilización de semillas.
Es importante tener en cuenta que todos estos pasos se realizan en una campana de flujo laminar para mantener las condiciones estériles. Todos los materiales, reactivos y medios de crecimiento necesarios se esterilizan en autoclave. Las líneas de semillas utilizadas son plgg1-1, abcb26 y WT o tipo silvestre.
Beba las semillas en agua estéril en una campana de flujo laminar, luego estratificar a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante dos días. En condiciones estériles, prepare 10 mililitros de solución de lejía de 50% de volumen a volumen y agregue aproximadamente 20 microlitros de Tween 20. Retire el agua de las semillas absorbidas, luego agregue un mililitro de solución de lejía en el tubo de microcentrífuga e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Retire la solución de lejía con una pipeta. Enjuague las semillas en un mililitro de agua estéril para resuspender. Retire el agua una vez que las semillas se hayan asentado en el fondo.
Resuspender las semillas en solución estéril de agarosa al 0,1%. Para el emplatado de semillas, placas medias basales con 1% de MS de medio con vitaminas y 1% de agar para el cultivo de los mutantes de prueba. Corte una punta de pipeta de 200 microlitros con una cuchilla de afeitar.
Usando una pipeta, coloque una semilla en el centro de la cuadrícula cuadrada designada para cada mutante o genotipo de prueba. Aquí, se utiliza una placa cuadrada con una cuadrícula de uno por uno centímetros. Esto ayuda a mantener una distancia uniforme entre cada plántula y evitar la superposición, lo que será importante más adelante en las imágenes y análisis de fluorescencia.
Una vez que las semillas hayan sido plateadas, envuelva la cinta quirúrgica alrededor de la tapa para sellar, luego colóquela en la cámara de crecimiento. Crecimiento vegetal y tratamiento bajo en CO2. Cultive plantas durante siete a nueve días a 20 grados centígrados bajo un ciclo de luz de ocho horas de 120 micromoles por metro cuadrado por segundo y 16 horas de oscuridad a 18 grados centígrados.
Revise las plantas en el sexto día para determinar si son lo suficientemente grandes para obtener imágenes. En el octavo día después del enchapado, exponga las plantas a niveles bajos de CO2. Coloque las plantas de tratamiento en una caja sellada dentro de la cámara de crecimiento con una intensidad de luz de 200 micromoles por metro cuadrado por segundo durante 12 horas.
La condición de bajo CO2 se construyó utilizando un recipiente transparente hermético con 100 gramos de cal sodada colocado en el fondo del contenedor. El contenedor se colocó dentro de la misma cámara de crecimiento que el control. Las plantas de control permanecerán por debajo de 120 micromoles por metro cuadrado por segundo en CO2 ambiente durante 12 horas.
Configure el sistema de imágenes de fluorescencia. Coloque una placa de prueba centrada debajo de la cámara a una distancia fija en el sistema de imágenes de fluorescencia. Dentro del software del instrumento, navegue hasta la ventana en vivo y marque la casilla Parpadeos para activar los destellos de medición no actínicos.
Haga clic en las herramientas de zoom y enfoque hasta que vea una imagen completa y nítida. Establezca el valor del obturador EL en cero y ajuste la sensibilidad para obtener una señal fluorescente en el rango de 200 a 500 unidades digitales. Coloque un medidor de luz en la misma posición utilizada para ajustar la configuración de la cámara.
En la ventana en vivo, marque la casilla Super para iniciar un pulso de saturación que dure 800 milisegundos. Use el control deslizante para ajustar el porcentaje de potencia relativa para el Super pulso hasta que el medidor de luz lea 6, 000 a 8, 000 micromoles por metro cuadrado por segundo. Medir el rendimiento cuántico de las muestras tratadas.
Inmediatamente después del tratamiento, cubra las placas con papel de aluminio durante 15 minutos para la adaptación a la oscuridad. Retire la lámina para medir el rendimiento cuántico del fotosistema dos con un fluorómetro modificado de amplitud de pulso. Luego coloque la placa de plántula directamente debajo de la cámara y ejecute el protocolo de rendimiento cuántico que se encuentra en nuestro repositorio de GitHub.
Descargue el protocolo Quantum Yield desde GitHub. Utilice un software de fluorómetro para abrir el archivo de programa haciendo clic en el icono de carpeta y navegando a la ubicación del archivo. Ejecute el protocolo de rendimiento cuántico haciendo clic en el icono del rayo rojo.
Una vez completado el protocolo, navegue hasta la ventana de análisis previo. Divida la placa en plántulas individuales resaltando todos los píxeles de cada plántula en la imagen de la placa. Haga clic en Exclusión de fondo para eliminar los píxeles de fondo resaltados, dejando solo el área de plántula.
Haga clic en analizar para generar datos de fluorescencia para cada plántula en la imagen de la placa. Ajuste manualmente el rango de valores de fluorescencia para mostrar valores mínimos y máximos consistentes entre todas las placas. En la pestaña Experimento, haga clic en Exportar y, a continuación, en Numérico.
Haga clic en Promedio numérico para generar un archivo de texto que contenga el rendimiento cuántico para cada plántula. Abra el archivo de texto y la hoja de cálculo para analizarlos. La hoja de cálculo contiene el número de área, el tamaño de los píxeles, Fm, Ft, Fq y QY. Primero, necesitamos identificar el número de área a su genotipo correspondiente, ya sea de tipo salvaje o un mutante de prueba, Resultados.
Aquí están las imágenes de placas de imágenes crudas y fluorescentes de la detección ambiental y de bajo CO2 de tipos salvajes y mutantes de prueba. Cada placa está etiquetada por número de área con las lecturas de fluorescencia correspondientes como rendimiento cuántico o QY. Los datos se exportan como un archivo de texto y se pueden abrir en una hoja de cálculo para su análisis. Las eficiencias de rendimiento cuántico Fv / Fm adaptadas a la oscuridad de los tipos salvajes y mutantes se visualizan mediante diagramas de caja y bigotes.
Para probar la diferencia estadística de los tipos salvajes y probar mutantes, se utilizó la prueba T por pares con un valor de P inferior a 0,05. Aquí, utilizamos la línea de mutante fotorrespiratorio con rendimiento cuántico reducido Fv / Fm como mutante de prueba para verificar la eficiencia de nuestro método de detección. Nuestros resultados muestran que los mutantes de prueba tienen una eficiencia de rendimiento cuántico significativamente menor en comparación con los tipos salvajes.
Esto indica que nuestro método de cribado es capaz de identificar mutantes fotorrespiratorios mediante cribado bajo en CO2. Conclusiones. Una cosa importante a recordar al usar este protocolo es asegurarse de que las plántulas de Arabidopsis sean lo suficientemente grandes como para medir la fluorescencia, pero no tan grandes como para que las plantas se superpongan durante la obtención de imágenes. Es preferible imaginar las plántulas como las primeras hojas verdaderas para tratar de mantener el tamaño y los ángulos de las hojas uniformes.
Este protocolo se puede utilizar como un cribado de alto rendimiento para plántulas. Las imágenes de cada placa son relativamente rápidas y tienen el potencial de examinar más de 1.000 plántulas por día. El análisis de fluorescencia de clorofila nos permitió identificar mutantes fotorrespiratorios utilizando un cribado de CO2 bajo, que es importante para mantener la eficiencia de la fotorrespiración.
Este protocolo no se limita a Arabidopsis y tiene el uso potencial para experimentos de respuesta al estrés abiótico.
