Este protocolo microscópico confocal permitirá la interpretación del comportamiento ecológico y las adaptaciones de microalgas de ambientes extremos con crecimiento lento en el laboratorio utilizando la autofluorescencia de sus pigmentos. Esta técnica no es invasiva y minimiza los artefactos ya que no se utilizan compuestos químicos. Conocer el rendimiento de los pigmentos de los autótrofos y el crecimiento correspondiente permitirá diseñar los métodos de control que son los de mayor interés para las cuevas turísticas y los monumentos arquitectónicos.
Comience a preparar el inóculo de Chroothece mobilis transfiriéndolo del cultivo de agar al medio de agua de mar o medio líquido SWES. Mantener todos los cultivos durante dos semanas con un fotoperiodo de 16 a 8 claros oscuros a 20 grados centígrados bajo una baja intensidad de luz blanca y sin agitar hasta obtener la densidad celular deseada. Utilice un mililitro del cultivo de fase exponencial que tiene cinco veces 10 a la tercera células por mililitro de densidad celular para inocular en una placa de 24 pocillos para diferentes experimentos.
Para reproducir el efecto de luz monocromática, use el filtro verde que permite que la luz verde pase de 470 a 570 nanómetros con un pico en la longitud de onda de 506 nanómetros y a la luz roja ajustada usando un filtro entre 590 y 720 nanómetros y picos a 678 nanómetros. Exponga los cultivos celulares a esta luz durante dos semanas. Encienda todos los componentes del microscopio de escaneo láser confocal invertido, incluido el láser.
Monte las células en el medio de crecimiento SWES desde cada pocillo experimental de la placa de 24 pocillos en un plato de fondo de vidrio de 35 milímetros para obtener imágenes. Elija el objetivo de inmersión en glicerol de apertura numérica 63X o 1.30 o NA y coloque glicerol sobre la lente. A continuación, coloque la placa del pozo en la etapa del microscopio asegurándose de que la muestra no se mueva durante la adquisición de la imagen.
Centra la muestra en la trayectoria de la luz y enfócate en el centro de la celda seleccionando el plano con la mayor intensidad de fluorescencia. Una vez hecho esto, abra el software de adquisición de imágenes y elija XY lambda de la lista desplegable en el modo de adquisición. Seleccione la línea de excitación del láser 561 nanómetros, ocho bits de rango dinámico y 1024 por 1024 píxeles.
Recopile los espectros de emisión de fluorescencia en el ancho de banda de 10 nanómetros y el tamaño del paso lambda de cuatro nanómetros dentro del rango de 570 a 760 nanómetros. Coloque el orificio en una unidad de aire y ejecute la adquisición de escaneo lambda. Después de repetir este proceso en diferentes campos de visión y bajo las diferentes condiciones de luces rojas y verdes, guarde todos los datos.
Una vez adquirido el escaneo lambda, haga clic en la ventana de cuantificación en la parte superior del software para evaluar los espectros de emisión de fluorescencia recopilados. Vaya a la ventana de abrir proyecto y seleccione un archivo lambda XY. Seleccione el análisis de perfiles apilados en el software de imágenes y defina una región de interés de cuatro micrómetros cuadrados en el centro de una celda para analizar la intensidad media de fluorescencia.
Exporte los datos y CSV antes de repetir el proceso con diferentes celdas en diferentes condiciones. A continuación, abra los archivos CSV para seleccionar los diferentes picos de emisión de fluorescencia de todas las regiones de interés medidas seleccionando los datos de fluorescencia máxima de ficoeritrina ficocianobilina, C.ficocianina, aloficocianina y clorofila A respectivamente en el archivo CSV. Una vez hecho esto, cree una nueva tabla con todos los valores máximos de fluorescencia obtenidos de cada pico de ficobiliproteína y clorofila y trace los datos en un gráfico.
Se observaron diferencias significativas en la intensidad media de fluorescencia. La intensidad media de fluorescencia de la ficoeritrina ficocianobilina disminuyó significativamente cuando las células fueron expuestas a luz verde monocromática. Por el contrario, no se observaron diferencias en la luz roja en comparación con el control.
La luz verde tuvo el efecto opuesto sobre la aloficocianina y la clorofila A en las que la intensidad media de fluorescencia aumentó significativamente debido a la adaptación de los complejos de antenas debido al aumento de la cantidad o la mejora de la conectividad de los complejos de antenas, entre otros. La luz roja produjo un aumento no significativo de la fluorescencia de aloficocianina y clorofila. Para estudiar el efecto de diferentes condiciones de crecimiento en las células en cultivo, es crucial realizar las mediciones con exactamente la misma configuración de microscopio.
Es posible analizar otros parámetros ambientales relevantes para el cultivo de organismos de autofluorescencia, así como la señal de fluorescencia dentro del espectro visible. Esta técnica es un enfoque muy poderoso para estudiar organismos de vida con varios pigmentos de autofluorescencia.
