Bu protokol, organellerin basit ve sağlam bir şekilde 3D rekonstrüksiyonuna izin verirken, şu anda uzman hacimli elektron mikroskoplarına sahip olmayan laboratuvarlar tarafından erişilebilir. Bu teknik son derece esnektir ve mükemmel X/Y çözünürlüğü sağlarken, gerektiğinde numuneleri yeniden görüntüleyebilir. Ayrıca çok yüksek Z çözünürlüğü gerektiğinde tilt tomografi ile de uyumludur.
Bu teknik, organeller arası bağlamda organel morfolojisinin sorgulanmasına izin verir. Bu nedenle, organel defekti olan herhangi bir patolojik durumu incelemek için genişletilebilir. Bu yaklaşım, organel etkileşimleri ve hücresel kaçakçılık olayları hakkında fikir verebilir.
Bu yöntem, hepatositlere ek olarak diğer dokulara, organoid modellere ve hücre kültürü sistemlerine de uygulanabilir. İlk kez kullananlar seri bölümlemeyi bulabilir ve kayıpsız olarak zorlu bir şekilde alabilirler. Bu protokolü değerli bir numuneye uygulamadan önce düzenli ultra ince kesitlemede yetkin olmanız önerilir.
Reçineye gömülü dokuyu, numune kırpma adaptöründe kilitli olacak şekilde bir tıraş bıçağı kullanarak dikkatlice kırparak başlayın. Numune arkını, mandren ve numune ile birlikte mikrotomun numune koluna aktarın ve numune arkını, geminin hareket aralığı yukarıdan aşağıya doğru uzanacak şekilde konumlandırın. Elmas bıçağı bıçak tutucusuna yerleştirin ve kilitleyerek bıçağın kesme açısının uygun şekilde ayarlandığından emin olun.
Bıçak tutucuyu sahneye güvenli bir şekilde kilitleyin. Sahne alanı aşağı aydınlatmasını kapatın, sahne alanı yukarı aydınlatmasını açın, bıçağı numuneye doğru dikkatli bir şekilde hareket ettirin, blok yüzü bıçağın kenarına hizalanana kadar ilgili düğmeleri ayarlayarak bıçağın yanal açısını, numune eğimini ve numune dönüşünü sürekli olarak ayarlayın. Numune kolunun kesme penceresinin üstünü ve altını ayarlayın ve numuneyi bıçak kenarının hemen altında bırakın.
Bıçaklı tekneyi temiz, çift damıtılmış suyla doldurun ve su yüzeyinin bıçağın kenarı ve hafif içbükey olduğu düz olduğundan emin olun. Ardından, bölümleri kesmeye başlayın. Numune bıçağın kenarından geçtikten hemen sonra kesmeyi durdurun.
Her kılavuzda toplanacak bölüm sayısını tahmin etmek için boş bir yuva ızgarası kullanın. Her elinizde bir kirpik kullanarak, şeridi yavaşça yuva ızgarasının uzunluğuna sığabilecek daha küçük şeritlere ayırın. Örnek içindeki göreceli konumlarını zihinsel olarak not edin.
Bir cam aplikatör çubuğu kullanarak, düzleştirmek için bölümlerin üzerine bir damla kloroform getirin. İlk numaralı forseps ile ilk boş yuva ızgarasını alın ve yavaşça Triton X-100'e ve ardından damıtılmış suya iki kez batırın. Forsepsin kenarındaki fazla suyu çıkarmak için bir parça filtre kağıdı kullanın.
Forseps kullanarak, formvar kaplı yuva ızgarasının yaklaşık 2 / 3'ünü bıçaklı teknenin suyuna yavaşça indirin. Formvar tarafının aşağı baktığından ve yuvanın uzun sağ kenarının su yüzeyinde ve su kenarına paralel olduğundan emin olun. Izgarayı yavaşça sudaki şeritlere doğru kaydırın, böylece dönüş vuruşunda bölümler ızgaraya doğru sürüklenir.
Bunu, şeridin sağ kenarı yuvanın sağ el kenarıyla aynı hizaya gelene kadar daha küçük ve daha küçük waft'larda yapmaya devam edin. Ardından, son waft ile, bölümleri yuva ızgarasına almak için ızgarayı yavaşça yukarı kaldırın. Karbondioksit içermeyen bir ortam sağlamak için Petri kabı kapağının altına birkaç sodyum hidroksit topağı yerleştirin.
Daha sonra, Reynold'un kurşun sitratının 40 mikrolitrelik damlalarını parafilm üzerine dikkatlice pipetleyin, her ızgara için bir damla. Her ızgarayı kurşun sitrat damlasına ters çevirin ve Petri kabı kapağı tarafından 7 ila 10 dakika boyunca korunarak bırakın. Izgaralar boyanırken, parafilm üzerine her ızgara için yaklaşık 300 mikrolitrelik beş damla damıtılmış su yerleştirin.
Kurşun sitrat inkübasyonunun sonunda, her ızgarayı doğrudan ızgaralarda nefes almadan bir dakika boyunca yıkamak için bir damla damıtılmış su damlacığına aktarın. Bunu dört kez daha tekrarlayın. İlk ızgarayı almak için numaralandırılmış çapraz forseps kullanın.
Suyun çoğunu fitillemek üzere kağıdı filtrelemek için ızgaranın kenarına dokunun ve forsepslerde en az 20 dakika kurumaya bırakın. Bunu her ızgara için tekrarlayın. Düşük büyütmede, seri bölümlerin sırasını, konumunu ve konumunu gözlemleyin.
Kılavuzdaki serinin orta bölümüne gidin. Örneğe göz atın ve ilgilenilen bir bölge belirleyin. Ardından, numuneyi istenen büyütmede gözlemleyin.
Seriyi biraz daha düşük bir büyütmede toplamayı düşünün, çünkü bölümler genellikle mükemmel bir şekilde hizalanmaz ve görüntülerin daha sonra kırpılması gerekebilir. Ardından, referans görüntüleri daha düşük büyütmelerde çekin. Bu, ilgi alanının bağlamını, bölüm sınırlarına göre farklı büyütmelerde kaba konumunu ve örneklemdeki yer işareti özelliklerini takdir etmeye yardımcı olacaktır.
İlgi alanını diğer bölümlere işaretlemek için bunları kullanın. Ekran referansı için, ekrana geçici işaretçiler yerleştirmek üzere yeniden kullanılabilir yapışkan macun, çıkartmalar veya ekrana bantlanmış bir parça tepegöz kağıdı kullanın. Bu, veri kümesi boyunca görüntünün merkezindeki ilgi bölgesinin aynı özelliklerinin rutin olarak yeniden tasarlanmasına olanak tanır.
Görüntü yığınını açın, voksel ölçümlerini belirtin ve segmentasyonu başlatmak için Segmentasyon sekmesini seçin. Malzeme listesinde yeni nesneler tanımlamak için segmentasyon düzenleyici panelinde Yeni'yi tıklatın. Nesnenin rengini değiştirmek için sağ tıklatın ve nesneyi yeniden adlandırmak için çift tıklatın.
Manuel segmentasyon için, malzeme listesinin altındaki segmentasyon aracını seçin ve pikselleri vurgulamak için varsayılan fırça aracını seçin. İki karşıt hepatositin elektron mikroskobu görüntüsü burada gösterilmiştir. Daha yüksek büyütmeli görüntüleme, nanometre çözünürlüğü ile farklı organellerin morfolojik detaylarının gözlemlenmesini sağlar.
Temsili görüntü, aynı tomogramın parçalanmış versiyonunu, endoplazmik retikulumun izini, mitokondri ve ER ile farklı boşlukların mitokondrileri arasındaki membranlar arası temasları göstermektedir. Temsili görüntü, segmentasyon izleri ve tüm mitokondri içindeki göreceli konumu ile kaplanmış eğimli bir orto-dilimi göstermektedir. Parçalı organellerin 3D rekonstrüksiyonu ve endoplazmik retikulum-mitokondri temasları burada gösterilmiştir.
Bu protokol çok yüksek Z çözünürlüğüne ihtiyaç duyulduğunda tilt tomografi ile uyumlu olduğu için küçük veya kıvrımlı yapıların çözülmesine yardımcı olur. Bu teknik, farklı organeller arasındaki uzamsal ilişkinin ilk değerlendirmesi için mükemmeldir ve bu nedenle, membran homeostazında membran temaslarının ilerleyen alanında özellikle yararlıdır.
