Questo protocollo consente la ricostruzione 3D degli organelli in modo semplice e robusto, pur essendo accessibile ai laboratori che attualmente non dispongono di microscopi elettronici di volume specialistici. Questa tecnica è estremamente flessibile, fornendo un'eccellente risoluzione X / Y, pur essendo in grado di ri-visualizzare i campioni se necessario. È anche compatibile con la tomografia inclinabile quando è richiesta una risoluzione Z molto elevata.
Questa tecnica consente interrogazioni della morfologia degli organelli in contesto inter-organello. Pertanto, può essere esteso per esaminare eventuali condizioni patologiche con difetti degli organelli. Questo approccio può fornire informazioni sulle interazioni degli organelli e sugli eventi di traffico cellulare.
Questo metodo può essere applicato anche ad altri tessuti, modelli organoidi e sistemi di coltura cellulare, oltre agli epatociti. Gli utenti per la prima volta possono trovare il sezionamento seriale e riprendere impegnativo senza perdita. Si raccomanda di essere abili nel regolare sezionamento ultrasottile prima di applicare questo protocollo a un campione prezioso.
Iniziare tagliando con cura il tessuto incorporato nella resina usando una lama di rasoio con il campione bloccato nell'adattatore di rifilatura. Trasferire l'arca campione insieme al mandrino e al campione nel braccio del campione del microtomo e posizionare l'arca campione in modo che l'intervallo di viaggio dell'arca vada dall'alto verso il basso. Posizionare e bloccare il coltello diamantato nel portacoltelli, assicurandosi che l'angolo di taglio del coltello sia impostato in modo appropriato.
Blocca saldamente il portacoltelli nel palco. Spegnere il downlighting del palco, accendere l'uplighting del palco, spostare con cautela il coltello verso il campione, regolando continuamente l'angolo laterale del coltello, l'inclinazione del campione e la rotazione del campione regolando le relative manopole fino a quando la faccia del blocco non è allineata al bordo del coltello. Impostare la parte superiore e inferiore della finestra di taglio del braccio del campione e lasciare il campione appena sotto il bordo del coltello.
Riempire la barca del coltello con acqua pulita e a doppio distillato e assicurarsi che la superficie dell'acqua sia a livello del bordo del coltello e leggermente concava. Quindi, inizia a tagliare le sezioni. Interrompere il taglio subito dopo che il campione ha superato il bordo del coltello.
Utilizzare una griglia di slot vuota per stimare il numero di sezioni da raccogliere su ciascuna griglia. Usando una ciglia in ogni mano, rompere delicatamente il nastro in nastri più piccoli che possono adattarsi alla lunghezza della griglia della fessura. Prendi nota mentalmente delle loro posizioni relative all'interno del campione.
Usando un'asta di applicazione di vetro, passa una goccia di cloroformio sulle sezioni per appiattirle. Prelevare la prima griglia di fessure vuote con la prima pinza numerata e immergerla delicatamente nel Triton X-100 e poi due volte nell'acqua distillata. Utilizzare un pezzo di carta da filtro per rimuovere l'acqua in eccesso dal bordo della pinza.
Usando la pinza, abbassare delicatamente circa 2/3 della griglia a fessura rivestita di formvar nell'acqua della barca del coltello. Assicurarsi che il lato del formvar sia rivolto verso il basso e che il lungo bordo destro della fessura sia sulla superficie dell'acqua e parallelo al bordo dell'acqua. Muovere delicatamente la griglia nell'acqua verso i nastri in modo che al momento del tratto di ritorno, le sezioni si spostino verso la griglia.
Continua a farlo in waft sempre più piccoli, fino a quando il bordo destro del nastro si allinea con il bordo destro dello slot. Quindi, con l'ultimo waft, porta delicatamente la griglia verso l'alto per raccogliere le sezioni nella griglia della fessura. Posizionare diversi pellet di idrossido di sodio sotto il coperchio di una capsula di Petri per fornire un ambiente privo di anidride carbonica.
Quindi, pipettare con cura gocce di 40 microlitri del citrato di piombo di Reynold sul parafilm, una goccia per ogni griglia. Capovolgere ogni griglia sulla goccia di citrato di piombo e lasciare protetto dal coperchio della capsula di Petri per 7-10 minuti. Mentre le griglie si colorano, posizionare cinque gocce di acqua distillata di circa 300 microlitri per ogni griglia sul parafilm.
Alla fine dell'incubazione del citrato di piombo, trasferire ogni griglia in una goccia di acqua distillata per lavare per un minuto senza respirare direttamente sulle griglie. Ripeti l'operazione altre quattro volte. Usa una pinza incrociata numerata per raccogliere la prima griglia.
Toccare il bordo della griglia per filtrare la carta per allontanare la maggior parte dell'acqua e lasciare asciugare nella pinza per almeno 20 minuti. Ripeti questa operazione per ogni griglia. A basso ingrandimento, osservare l'ordine, la posizione e la posizione delle sezioni seriali.
Passare alla sezione centrale della serie sulla griglia. Sfoglia l'esempio e identifica un'area di interesse. Quindi, osservare il campione all'ingrandimento desiderato.
Prendi in considerazione la possibilità di raccogliere la serie con un ingrandimento leggermente inferiore, poiché le sezioni spesso non sono perfettamente allineate e le immagini potrebbero dover essere ritagliate in seguito. Quindi, scatta immagini di riferimento a ingrandimenti inferiori. Ciò contribuirà ad apprezzare il contesto della regione di interesse, la sua posizione approssimativa a diversi ingrandimenti in relazione ai confini della sezione e le caratteristiche del punto di riferimento all'interno del campione.
Usali per segnalare la regione di interesse in altre sezioni. Per il riferimento allo schermo, utilizzare stucco adesivo riutilizzabile, adesivi o un pezzo di carta per lavagna luminosa fissato sullo schermo per posizionare marcatori temporanei sullo schermo. Ciò consentirà di re-immaginare di routine le stesse caratteristiche della regione di interesse al centro dell'immagine in tutto il set di dati.
Aprire lo stack di immagini, specificare le misurazioni voxel e selezionare la scheda Segmentazione per avviare la segmentazione. Fate clic su Nuovo nel pannello dell'editor di segmentazione per definire nuovi oggetti nell'elenco dei materiali. Fare clic con il pulsante destro del mouse per modificare il colore dell'oggetto e fare doppio clic per rinominare l'oggetto.
Per la segmentazione manuale, scegliete lo strumento di segmentazione sotto l'elenco dei materiali e selezionate lo strumento pennello predefinito per evidenziare i pixel. L'immagine al microscopio elettronico di due epatociti opposti è mostrata qui. L'imaging ad ingrandimento più elevato consente l'osservazione dei dettagli morfologici dei diversi organelli con risoluzione nanometrica.
L'immagine rappresentativa mostra la versione segmentata dello stesso tomogramma, la traccia del reticolo endoplasmatico, i mitocondri e i contatti intermembrana tra l'ER e i mitocondri di spazi diversi sono mostrati qui. L'immagine rappresentativa mostra un'orto-fetta inclinata sovrapposta a tracce di segmentazione e la sua posizione relativa all'interno dell'intero mitocondrio. La ricostruzione 3D degli organelli segmentati e dei contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici a diverse angolazioni sono mostrati qui.
Poiché questo protocollo è compatibile con la tomografia inclinabile quando è necessaria una risoluzione Z molto elevata, aiuta a risolvere strutture piccole o contorte. Questa tecnica è perfetta per la valutazione iniziale della relazione spaziale tra diversi organelli e, quindi, particolarmente utile nel campo progressivo dei contatti di membrana all'omeostasi di membrana.
