Этот протокол позволяет проводить 3D-реконструкцию органелл простым и надежным способом, будучи доступным для лабораторий, которые в настоящее время не имеют специализированных объемных электронных микроскопов. Этот метод чрезвычайно гибок, обеспечивая отличное разрешение X / Y, в то же время имея возможность повторно изображать образцы при необходимости. Он также совместим с наклонной томографией, когда требуется очень высокое разрешение Z.
Этот метод позволяет исследовать морфологию органелл в межорганельном контексте. Поэтому его можно расширить для обследования любых патологических состояний с дефектами органелл. Этот подход может дать представление о взаимодействиях органелл и событиях клеточного трафика.
Этот метод также может быть применен к другим тканям, органоидным моделям и системам клеточных культур, в дополнение к гепатоцитам. Начинающие пользователи могут найти последовательное секционирование и подобрать вызов без потерь. Рекомендуется владеть регулярным ультратонким сечением, прежде чем применять этот протокол к драгоценному образцу.
Начните с тщательной обрезки ткани, встроенной в смолу, с помощью лезвия бритвы с образцом, запертым в адаптере для обрезки. Перенесите образец ковчега вместе с патроном и образцом на образец руки микротома и расположите образец ковчега так, чтобы диапазон перемещения ковчега простирался сверху вниз. Поместите и зафиксируйте алмазный нож в держателе ножа, убедившись, что угол резания ножа установлен соответствующим образом.
Надежно зафиксируйте держатель ножа в сцене. Выключите понижающее освещение сцены, включите подсветку сцены, осторожно переместите нож к образцу, постоянно регулируя боковой угол ножа, наклон образца и вращение образца, регулируя соответствующие ручки, пока лицевая сторона блока не будет выровнена по краю ножа. Установите верхнюю и нижнюю части режущего окна руки образца и оставьте образец чуть ниже края ножа.
Наполните лодку с ножом чистой, дважды дистиллированной водой и убедитесь, что поверхность воды равна кромке ножа и слегка вогнута. Затем приступайте к резке секций. Прекратите резку сразу после того, как образец пройдет лезвие ножа.
Используйте сетку пустых слотов, чтобы оценить количество секций для сбора в каждой сетке. Используя ресницы в каждой руке, аккуратно разбейте ленту на более мелкие ленты, которые могут поместиться в длину сетки слота. Мысленно запишите их относительное положение в выборке.
Используя стеклянный стержень аппликатора, наведите каплю хлороформа на секции, чтобы сгладить их. Возьмите первую пустую щелевую сетку с первыми пронумерованными щипцами и осторожно окуните ее в Triton X-100, а затем два раза в дистиллированную воду. Используйте лист фильтровальной бумаги, чтобы удалить лишнюю воду с края щипцов.
Используя щипцы, осторожно опустите примерно 2/3 щелевой сетки с покрытием в воду ножевой лодки. Убедитесь, что сторона формвара обращена вниз, а длинный правый край прорези находится на поверхности воды и параллельно кромке воды. Осторожно положите сетку в воде к лентам, чтобы при обратном ударе секции дрейфовали к сетке.
Продолжайте делать это все меньшими и меньшими взмахами, пока правый край ленты не выровняется с правым краем прорези. Затем, с последним взмахом, осторожно поднесите сетку вверх, чтобы поднять секции в сетку слотов. Поместите несколько гранул гидроксида натрия под крышку чашки Петри, чтобы обеспечить среду, свободную от углекислого газа.
Затем аккуратно пипетку 40-микролитровой капли свинцового цитрата Рейнольда на парапленку, по одной капле на каждую сетку. Переверните каждую сетку на каплю цитрата свинца и оставьте защищенной крышкой чашки Петри на 7-10 минут. Пока сетки окрашиваются, поместите пять примерно 300-микролитровых капель дистиллированной воды на каждую сетку на парапленке.
В конце инкубации свинцового цитрата переложите каждую сетку на каплю дистиллированной воды для промывания в течение одной минуты, не дыша прямо на сетках. Повторите это еще четыре раза. Используйте пронумерованные перекрестные щипцы, чтобы подобрать первую сетку.
Прикоснитесь к краю сетки, чтобы фильтровать бумагу, чтобы отвести большую часть воды и дать высохнуть в щипцах не менее 20 минут. Повторите это для каждой сетки. При небольшом увеличении следите за порядком, расположением и положением последовательных секций.
Перейдите к средней части серии на сетке. Просмотрите образец и определите интересующий регион. Затем понаблюдайте за образцом при нужном увеличении.
Рассмотрите возможность сбора рядов при немного меньшем увеличении, так как участки часто не идеально выровнены, и изображения, возможно, придется обрезать позже. Затем сделайте эталонные изображения с меньшим увеличением. Это поможет оценить контекст интересующего региона, его грубое расположение при разных увеличениях по отношению к границам секций и ориентировочные особенности в выборке.
Используйте их, чтобы обозначить интересующий регион в других разделах. Для ссылок на экран используйте многоразовую клеевую шпаклевку, наклейки или кусок бумаги для проектора, прикрепленный к экрану, чтобы разместить временные маркеры на экране. Это позволит рутинно переосмысливать одни и те же особенности интересующей области в центре изображения по всему набору данных.
Откройте стек изображений, укажите измерения вокселя и перейдите на вкладку Сегментация, чтобы начать сегментацию. Нажмите кнопку Создать на панели редактора сегментации, чтобы определить новые объекты в списке материалов. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы изменить цвет объекта, и дважды щелкните, чтобы переименовать объект.
Для сегментации вручную выберите инструмент сегментации под списком материалов и выберите инструмент кисти по умолчанию, чтобы выделить пикселы. Здесь показано изображение электронной микроскопии двух противоположных гепатоцитов. Визуализация с более высоким увеличением позволяет наблюдать морфологические детали различных органелл с нанометровым разрешением.
Репрезентативное изображение показывает сегментированную версию той же томограммы, здесь показаны следы эндоплазматического ретикулума, митохондрий и межмембранные контакты между ER и митохондриями разных пространств. Репрезентативное изображение показывает наклонный орто-срез, наложенный на следы сегментации и его относительное положение во всей митохондрии. Здесь показана 3D-реконструкция сегментоядерных органелл и контактов эндоплазматического ретикулума-митохондрий под разными углами.
Поскольку этот протокол совместим с наклонной томографией, когда требуется очень высокое разрешение Z, он помогает разрешать небольшие или запутанные структуры. Этот метод идеально подходит для первоначальной оценки пространственных отношений между различными органеллами, и, следовательно, особенно полезен в прогрессирующем поле мембранных контактов при мембранном гомеостазе.
