Dieses Protokoll ermöglicht die 3D-Rekonstruktion von Organellen auf einfache und robuste Weise, während es für Labors zugänglich ist, die derzeit nicht über spezielle Volumenelektronenmikroskope verfügen. Diese Technik ist extrem flexibel und bietet eine hervorragende X / Y-Auflösung, während sie bei Bedarf in der Lage ist, Proben erneut abzubilden. Es ist auch mit der Neigungstomographie kompatibel, wenn eine sehr hohe Z-Auflösung erforderlich ist.
Diese Technik ermöglicht die Abfrage der Organellenmorphologie im interorganellen Kontext. Daher kann es erweitert werden, um pathologische Zustände mit Organellendefekten zu untersuchen. Dieser Ansatz kann Einblicke in Organelleninteraktionen und zelluläre Handelsereignisse geben.
Diese Methode kann neben Hepatozyten auch auf andere Gewebe, Organoidmodelle und Zellkultursysteme angewendet werden. Erstbenutzer können serielle Abschnitte finden und ohne Verlust eine Herausforderung darstellen. Es wird empfohlen, sich mit regelmäßigen ultradünnen Schnitten vertraut zu machen, bevor Sie dieses Protokoll auf eine wertvolle Probe anwenden.
Beginnen Sie mit dem sorgfältigen Trimmen des in Harz eingebetteten Gewebes mit einer Rasierklinge, wobei die Probe im Trimmadapter eingeschlossen ist. Übertragen Sie die Probenarche zusammen mit dem Futter und der Probe auf den Probenarm des Mikrotoms und positionieren Sie die Probenarche so, dass die Reichweite der Arche von oben nach unten verläuft. Legen Sie das Diamantmesser in den Messerhalter und verriegeln Sie es, um sicherzustellen, dass der Schnittwinkel des Messers entsprechend eingestellt ist.
Verriegeln Sie den Messerhalter sicher in der Bühne. Schalten Sie die Bühnenbeleuchtung aus, schalten Sie die Bühnenbeleuchtung ein, bewegen Sie das Messer vorsichtig in Richtung der Probe und passen Sie den seitlichen Winkel des Messers, die Neigung der Probe und die Probenrotation kontinuierlich an, indem Sie die entsprechenden Knöpfe einstellen, bis die Blockfläche an der Messerkante ausgerichtet ist. Stellen Sie die Ober- und Unterseite des Schneidfensters des Probenarms ein und lassen Sie die Probe direkt unter der Messerkante.
Füllen Sie das Messerboot mit sauberem, doppelt destilliertem Wasser und stellen Sie sicher, dass die Wasseroberfläche auf Augenhöhe mit der Messerkante und leicht konkav ist. Beginnen Sie dann mit dem Schneiden von Abschnitten. Stoppen Sie das Schneiden, kurz nachdem die Probe die Messerkante passiert hat.
Verwenden Sie ein leeres Steckplatzraster, um die Anzahl der Abschnitte zu schätzen, die in jedem Raster gesammelt werden sollen. Brechen Sie das Band mit einer Wimpern in jeder Hand vorsichtig in kleinere Bänder, die in die Länge des Schlitzgitters passen. Notieren Sie sich ihre relativen Positionen innerhalb der Stichprobe.
Bewegen Sie mit einem Glasapplikatorstab einen Tropfen Chloroform über die Abschnitte, um sie abzuflachen. Nehmen Sie das erste leere Schlitzgitter mit der ersten nummerierten Pinzette auf und tauchen Sie es vorsichtig in die Triton X-100 und dann zweimal in das destillierte Wasser. Verwenden Sie ein Stück Filterpapier, um das überschüssige Wasser von der Zangenkante zu entfernen.
Senken Sie mit einer Pinzette vorsichtig etwa 2/3 des formvarbeschichteten Schlitzgitters in das Wasser des Messerbootes. Stellen Sie sicher, dass die Formvar-Seite nach unten zeigt und die lange rechte Kante des Schlitzes an der Wasseroberfläche und parallel zur Wasserkante liegt. Wehen Sie das Gitter sanft im Wasser in Richtung der Bänder, so dass beim Rückwärtsstrich die Abschnitte zum Gitter driften.
Tun Sie dies weiterhin in immer kleineren Schwadronen, bis sich der rechte Rand des Bandes mit dem rechten Rand des Schlitzes ausrichtet. Bringen Sie dann mit dem letzten Waft das Raster vorsichtig nach oben, um die Abschnitte in das Slot-Gitter aufzunehmen. Legen Sie mehrere Pellets Natriumhydroxid unter einen Petrischalendeckel, um eine kohlendioxidfreie Umgebung zu schaffen.
Pipettieren Sie dann vorsichtig 40-Mikroliter-Tropfen von Reynolds Bleicitrat auf den Parafilm, einen Tropfen für jedes Gitter. Drehen Sie jedes Gitter auf den Bleicitratabfall um und lassen Sie es 7 bis 10 Minuten durch den Petrischalendeckel geschützt stehen. Während die Gitter färben, legen Sie fünf etwa 300-Mikroliter-Tropfen destilliertes Wasser für jedes Gitter auf den Parafilm.
Am Ende der Bleicitrat-Inkubation wird jedes Gitter in einen Tröpfchen destilliertes Wasser überführt, um es eine Minute lang zu waschen, ohne direkt auf den Gittern zu atmen. Wiederholen Sie dies vier weitere Male. Verwenden Sie nummerierte Crossover-Pinzetten, um das erste Raster aufzunehmen.
Berühren Sie den Rand des Gitters, um das Papier zu filtern, um den größten Teil des Wassers abzuleiten und mindestens 20 Minuten in der Pinzette trocknen zu lassen. Wiederholen Sie dies für jedes Raster. Beobachten Sie bei geringer Vergrößerung die Reihenfolge, Position und Position der seriellen Abschnitte.
Navigieren Sie zum mittleren Abschnitt der Serie im Raster. Durchsuchen Sie das Beispiel, und identifizieren Sie eine Region von Interesse. Beobachten Sie dann die Probe bei der gewünschten Vergrößerung.
Erwägen Sie, die Serie mit einer etwas geringeren Vergrößerung zu sammeln, da Abschnitte oft nicht perfekt ausgerichtet sind und Bilder möglicherweise später zugeschnitten werden müssen. Als nächstes nehmen Sie Referenzbilder bei geringerer Vergrößerung auf. Auf diese Weise können Sie den Kontext der Region von Interesse, die ungefähre Position bei verschiedenen Vergrößerungen in Bezug auf Abschnittsgrenzen und die Markierungsmerkmale innerhalb des Beispiels würdigen.
Verwenden Sie diese, um die Region von Interesse in anderen Abschnitten zu kennzeichnen. Verwenden Sie für die Bildschirmreferenzierung wiederverwendbaren Klebekitt, Aufkleber oder ein Stück Overheadprojektorpapier, das auf den Bildschirm geklebt wird, um temporäre Markierungen auf dem Bildschirm zu platzieren. Dies ermöglicht eine routinemäßige Neudarstellung der gleichen Merkmale der interessierenden Region in der Mitte des Bildes im gesamten Datensatz.
Öffnen Sie den Image-Stack, geben Sie die Voxelmessungen an und wählen Sie die Registerkarte Segmentierung, um die Segmentierung zu starten. Klicken Sie im Bedienfeld des Segmentierungseditors auf Neu, um neue Objekte in der Materialliste zu definieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Farbe des Objekts zu ändern, und doppelklicken Sie, um das Objekt umzubenennen.
Wählen Sie für die manuelle Segmentierung das Segmentierungswerkzeug unter der Materialliste und wählen Sie das Standardpinselwerkzeug aus, um die Pixel hervorzuheben. Hier ist das elektronenmikroskopische Bild von zwei gegenüberliegenden Hepatozyten dargestellt. Die Bildgebung mit höherer Vergrößerung ermöglicht die Beobachtung der morphologischen Details der verschiedenen Organellen mit Nanometerauflösung.
Das repräsentative Bild zeigt die segmentierte Version desselben Tomogramms, Spuren des endoplasmatischen Retikulums, Mitochondrien und die Intermembrankontakte zwischen der Notaufnahme und den Mitochondrien verschiedener Räume. Das repräsentative Bild zeigt eine geneigte Orthoscheibe, die mit Segmentierungsspuren und ihrer relativen Position innerhalb des gesamten Mitochondriums überlagert ist. Hier wird eine 3D-Rekonstruktion der segmentierten Organellen und der endoplasmatischen Retikulum-Mitochondrien-Kontakte in verschiedenen Winkeln gezeigt.
Da dieses Protokoll mit der Neigungstomographie kompatibel ist, wenn eine sehr hohe Z-Auflösung erforderlich ist, hilft es, kleine oder verworrene Strukturen aufzulösen. Diese Technik eignet sich perfekt für die erste Beurteilung der räumlichen Beziehung zwischen verschiedenen Organellen und ist daher besonders nützlich im fortschreitenden Feld von Membrankontakten an der Membranhomöostase.
